三角帆蚌(Hypriosis cumingii)是我国特有的淡水育珠蚌,所产淡水珍珠产量占珍珠总量的80%,在珍珠产业中占有非常重要的地位。三角帆蚌贝壳和珍珠都是碳酸钙生物矿化的产物,形成碳酸钙结晶产物的生物矿化过程是在一系列基质蛋白的指导和调控下进行的。鉴定基质蛋白以及探究它们的生物矿化功能对理解贝壳和珍珠的形成机理具有重要的意义。有关贝壳基质蛋白的研究大多集中于海水贝类,淡水贝类壳基质蛋白的报道较少。为了更深入地探究三角帆蚌贝壳和珍珠形成的机理,本研究从三角帆蚌外套膜中鉴定出两个新的贝壳基质蛋白基因,hic31和hic52,并对其结构和功能进行了初步研究。1.三角帆蚌hic31基因的克隆和表达分析从三角帆蚌外套膜中克隆得到了hic31基因,对其进行了序列和结构、组织表达分析及原位杂交检测。利用RACE技术,获得hic31基因的cDNA序列全长为1432bp,开放阅读框为957bp,共编码318个氨基酸,其中1-18个氨基酸为信号肽,去除信号肽后理论分子量28.82 kDa,等电点为7.00,为一中性基质蛋白。hic31蛋白的氨基酸序列富含甘氨酸(Gly),占氨基酸总数的26.67%,且Gly在N端常聚集在一起,以(Gly)n(n=3-7)的形式,形成4个甘氨酸聚集簇。Met/Ser常伴随甘氨酸聚集簇,在序列中形成(Gly)m X(Gly)n(m>1,n>1,X指的是Met/Ser)重复片段。hic31蛋白的二级结构主要以α-helix为主,其高级结构预测为一细丝状的蛋白质,并与胶原蛋白Type I,α1和α2具有结构相似性,同时,通过荧光定量和原位杂交发现,hic31基因特异地表达于三角帆蚌外套膜,且在外套膜中边缘膜中的表达量明显高于缘膜部和中央膜,而且原位杂交检测时仅在外套膜边缘膜外上皮细胞中检测有强烈信号,表明hic31蛋白是一个棱柱层基质蛋白,很可能是作为一个框架蛋白参与棱柱层的矿化。2.三角帆蚌hic52基因的克隆和表达分析从三角帆蚌外套膜中克隆得到了hic52基因,并对hic52基因进行了序列和结构、表达分析。结果显示,hic52基因的cDNA全长序列为2053bp,ORF为1629bp,共编码543个氨基酸。其中信号肽为前18个氨基酸,除去信号肽,预测的理论分子量52.2kDa,等电点为10.37,为一碱性蛋白。氨基酸组成分析发现,hic52蛋白是由大量的Gly(28.8%)和Gln(12.4%)组成,在序列中呈现出高频率的重复片段的特点:(1)Gly主要在N端形成多个甘氨酸簇(Gly)n(n>2);(2)Gln和Asn主要分布在序列中间和C端,并且存在两个特别的重复区域,即(Gln)2Asn(Gln)4(Asn)2和(Gln)4Asn(Gln)4(Asn)2;(3)在序列中间存在2个连续的Thr-Ser-Pro、2个对称连续的Thr-Asn-Gln重复片段、2个Gly-Gln-X-Gly-Asn-Gly-Gln重复片段(X指的是Gln和Glu);(4)在C端,存在(Gly-X-Gly-Y)n重复片段,其中X,Y为M/S/Q/G/F/I/N。所有这些基序都很有可能与钙结合或者与晶体相互作用相关。二级结构预测发现hic52蛋白在C端含有一个由29个氨基酸组成的长α-螺旋结构,且hic52蛋白的高级结构也与胶原蛋白Type I,alpha 1和alpha 2的呈现一定程度的结构相似性。组织表达分析发现,hic52基因特异地表达于三角帆蚌外套膜,且在外套膜中,中央膜的表达量最高。原位杂交时在外套膜背部中央膜部分外上皮细胞中检测到了强烈的信号,综合分析可以推出,hic52蛋白主要是一个与珍珠层形成相关的基质蛋白。3.hic31基因和hic52基因在珍珠形成过程中的功能研究设计插片实验并结合光学显微镜研究hic31基因和hic52基因在贝壳和珍珠生物矿化中的功能。通过选取健康规格一致的三角帆蚌个体进行无核珍珠插核手术,定期进行珍珠囊组织取样用于后期荧光定量分析,以及收集珍珠小颗粒用于后期光学显微镜下观察表面形貌。荧光定量结果表明,hic31基因在珍珠囊发育至23天前表达量上升迅速,而在23天后表达量下降明显;而hic52基因则是在珍珠囊发育12天前表达一直保持很低水平,在12-23天之间表达量稍有升高,而在23天之后,hic52基因的表达量上升十分明显,直至77天观察到该基因处于低表达状态。而光学显微镜观察表明,珍珠颗粒发育到23天首次明显观察到珍珠光泽。因此,结合珍珠囊发育不同时期基因的表达规律与珍珠小颗粒的光学显微镜观察结果,可以进一步证明hic31蛋白主要是负责棱柱层矿化,而hic52蛋白则主要是参与珍珠层的矿化,因而更好地证明了两个蛋白在珍珠形成和生物矿化过程各自发挥的不同功能。