Ⅰ群禽腺病毒核酸检测方法及DNA疫苗的研究

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I群禽腺病毒属于禽腺病毒科禽腺病毒属主要包括12个血清型,各血清型毒株之间含有相同的群特异性抗原,鸡胚致死孤儿病毒、鸡包涵体肝炎病毒等为I群禽腺病毒中较为常见的毒株。不同日龄的家禽和野生鸟类均可感染I群禽腺病毒,引起典型的临床症状如:包涵体肝炎、贫血和生产能力下降,给养禽业带来极大危害。[1]。   利用两对引物分别对I群禽腺病毒的12个血清型毒株的hexon基因的A、B两个片段进行扩增。其中A片段大小为1219bp,B片段为1350bp。通过对所扩增片段的序列和限制性酶切位点分析,选择限制性内切酶Hae II对扩增产物进行酶切片段多态性分析。结果,本研究所扩增的I群禽腺病毒的12个血清型毒株的目的片段,其酶切片段呈现多态性。表明该限制性内切酶能对I群禽腺病毒的12个血清型进行分型。   根据I群禽腺病毒hexon基因保守区序列,设计一套特异性LAMP引物,建立了一种适用于I群禽腺病毒的LAMP快速检测方法。结果表明该方法可以特异的扩增出I群禽腺病毒的12个血清型标准毒株,对构建的I群禽腺病毒质粒DNA最小检测限可达lxl01拷贝/μL;LAMP方法对临床样品的检出率高于PCR方法;在扩增产物中添加SYBR Green I染料后可通过肉眼观察有无荧光产生而对结果进行直接判定。本研究建立的LAMP方法简便、快速、灵敏、特异性高,可作为I群禽腺病毒感染的快速诊断方法。   利用针对I群禽腺病毒(AAV)检测的普通PCR,半巢式PCR,Real-timePCR,和LAMP四种核酸检测方法对不同质粒浓度的样品和临床疑似样品进行检测,比较四种核酸检测方法的敏感度。并与与传统的病毒分离方法进行对比。结果四种核酸检测方法中Real-time PCR最为敏感,可以检测到1xlOO拷贝/μL,LAMP与半巢式PCR其次可以检测到1×101拷贝/μL,普通PCR只能检测到1xl03拷贝/μL。结合临床疑似病料检出结果表明在实践中根据实际情况需要选择合适的检测法对I群禽腺病毒(AAV)进行检测是十分必要的。   将I群禽腺病毒CELO株的hexon基因与鸡IL-2基因进行连接,将融合基因克隆进真核表达载体pcDNA3.1中构建了pcDNA3.1-hexon-Linkcr-ChIL2融合基因重组真核表达载体。并将该重组质粒转染Vero细胞,通过RT-PCR、免疫荧光试验对重组质粒的体外瞬时表达情况进行检测鉴定。检测结果显示,成功构建了pcDNA3.1-hexon-Linker-ChlL2融合基因重组载体,并在Vero细胞中获得表达。   将重组载体pcDNA3.1-hexon-Linker-ChIL2大量纯化后,通过胸部肌肉多点注射的方法免疫三周龄SPF鸡,每只鸡200μg。同时设立pcDNA3.1-hexon组,灭活苗对照组,空载体对照组,及空白对照组。免疫后每周采血一次,ELISA方法检测抗体水平。于第5周进行攻毒实验,并于攻毒后的3天,5天,7天,14天采集各组鸡的肛门绵拭子,检测排毒情况。结果显示pcDNA3.1-hexon-Linker-ChlL2组,灭活苗组的抗体水平要明显高于其它组能更好的抑制排毒。   为了研究免疫DNA疫苗以后其在体内的动态分布情况、在各组织的出现和消失时间。用pcDNA3.1-hexon-Linker-ChIL2质粒对3周龄的SPF鸡进行胸肌多点注射,每只鸡200ug,接种后的不同时间分别对鸡的心,肝脏,脾脏,肺,肾脏,胸腺,法氏囊,肠,接种部位肌肉以及血液采用Real-time-PCR和半巢式PCR方法进行检测。结果在接种DNA疫苗1~3小时以后血液中可以检测到pcDNA3.1-hexon-Linker-ChlL2,3小时~1天上述各组织器官陆续可以检测到DNA疫苗陆续出现。14d以后各组织器官的DNA疫苗开始陆续消失,肌肉接种部位105d时仍然可以检出DNA疫苗。本研究为DNA疫苗的临床应用提供理论及数据支持。
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