为了建立稳定表达流感病毒HA、NA蛋白的MDCK细胞系,本研究利用含有嘌呤霉素抗性基因的pMX载体,在启动子下游的AgeI和NotI两个限制性内切酶位点之间插入流感病毒PR8的HA基因,NotI和XholI两个限制性内切酶位点之间分别插入H5N1亚型流感病毒的HA基因、NA基因、H9N2亚型流感病毒的NA基因开放阅读框(ORF),构建了四个质粒载体pMX-PR8HA、pMX-GDHA、pMX-GDNA、pMX-H9N2NA,分别将pMX-PR8HA、pMX-GDHA、pMX-GDNA、pMX- H9N2NA依次连同3个分别表达VSVG、gag/pol和NF-KB的质粒共同转染293T细胞产生逆转录病毒样颗粒,用逆转录病毒样颗粒感染MDCK细胞,将感染后的MDCK细胞利用嘌呤霉素进行筛选,细胞克隆传十代后,通过PCR、RT-PCR、IFA和western blot鉴定。结果证明,获得了能稳定表达PR8流感病毒的HA蛋白、H5N1亚型流感病毒的HA蛋白和NA蛋白、H9N2亚型流感病毒的NA蛋白的4个MDCK细胞系。4个细胞系的建立为流感病毒表达外源基因研究提供必要的保障。为了验证这些细胞系能否支持相应基因缺失流感病毒的增殖,通过反向遗传操作技术在293T细胞上拯救出缺失NA基因的流感病毒,用此缺陷性病毒感染表达H5N1亚型流感病毒NA蛋白的细胞后,获得了能在该细胞系上增殖、传代的NA缺失流感病毒。通过本研究建立的在稳定表达流感病毒蛋白的细胞系上增殖基因缺失的高致病性流感病毒的方法,为生物安全级别较低的实验室开展高致病性流感病毒研究奠定了基础。另外本实验还测定了构建H9N2NA细胞系的野毒株NA基因,并对这一毒株的NA基因序列进行了分析。