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第一部分:单核细胞诱导肺泡上皮细胞转分化肺纤维化的实验研究 背景:急性呼吸窘迫综合征(acuterespiratorydistresssyndrome，ARDS)以肺部失控的炎症反应及异常的组织重建为主要特征。肺泡上皮细胞在各种刺激因素下可转分化为间质细胞，是肺纤维化过程中成纤维细胞增加的主要原因之一。ARDS时肺组织局部单核细胞大量浸润，但是单核细胞浸润是否会诱导肺泡上皮细胞转分化(epithelial-mesenchymaltransition，EMT)，加重ARDS肺纤维化，需要进一步的探讨。 目的:本研究拟复制盐酸(hydrochloricacid,HCl)诱导的肺泡上皮细胞损伤模型，观察单核细胞共培养对HCl刺激损伤的人肺泡上皮细胞转分化的影响，然后借助于淋巴细胞功能相关抗原(lymphocytefunction-associatedantigen，LFA)-1短肽阻断单核细胞-肺泡上皮细胞的直接接触，探明单核细胞促进损伤的肺泡上皮细胞发生EMT、诱导纤维化的机制。 方法:(1)以HCl(pH4.0DMEM培养液)刺激肺泡上皮细胞株(BEAS-2B细胞)30min复制酸吸入性肺损伤的体外模型，MTT法观察细胞活性的变化，台盼蓝染色观察细胞的死亡百分率，测定培养上清液中乳酸脱氢酶(lacticdehydrogenase，LDH)的浓度反映细胞的受损程度，WesternBlot方法检测细胞黏附分子(intercellularadhesionmolecule，ICAM)-1的表达。(2)将单核细胞株(U937)与HCl损伤的BEAS-2B细胞共培养24或48h，WesternBlot方法检测BEAS-2B细胞上皮特异性蛋白E-钙粘蛋白(E-cadherin)及间质特异性蛋白α-平滑肌肌动蛋白(SMA)的表达情况，碱水解法检测培养上清液中羟脯氨酸浓度，ELISA方法测定培养上清液中的白介素(interleukin，IL)-8和血小板源性生长因子(plateletderivedgrowthfactor,PDGF)的浓度。(3)以0.1、0.5或1mM的LFA-1短肽（含有LFA-1活性位点，可与单核细胞表面的LFA-1竞争性结合于肺泡上皮细胞表面的ICAM-1分子)CD11a237-246和/或CD18112-122预处理HCl损伤的BEAS-2B细胞30min，再加入绿色荧光染料(Calcein-AM)标记的U937细胞共培养48h，荧光显微镜下观察U937细胞黏附的情况，多功能酶标仪检测黏附的单核细胞荧光强度。(4)以CD11a237-246和/或CD18112-122预处理HCl损伤的BEAS-2B细胞30min，再加入U937细胞共培养48h，检测E-cadherin、α-SMA、羟脯氨酸、IL-8及PDGF的变化。 结果: (1)酸刺激复制ALI体外模型的鉴定:HCl刺激30min后BEAS-2B细胞活性降低至71.7％，死亡细胞数占总细胞数的18.4％，培养上清液中LDH、IL-8均明显增加（P＜0.05）。 (2)U937细胞对损伤的BEAS-2B细胞转分化的影响:在HCl刺激后与U937细胞共培养24h和48h，BEAS-2B细胞E-cadherin的表达显著受到抑制，而α-SMA的表达也明显增加(P＜0.05），提示BEAS-2B细胞发生了EMT;在共培养48h后细胞培养液中羟脯氨酸的含量也显著增加了(P＜0.05）。 (3)阻断U937细胞-BEAS-2B细胞直接接触对BEAS-2B细胞转分化的影响:BEAS-2B细胞损伤后细胞表面的ICAM-1表达显著增加，BEAS-2B细胞与U937细胞间的黏附也明显增加(P＜0.05);CD11a237-246(0.5mM和1mM)、CD18112-122(1mM)均能通过竞争性与ICAM-1结合，有效的抑制BEAS-2B细胞与U937细胞间的黏附(P＜0.05)。给予CD11a237-246或CD18112-122短肽的预处理后，共培养体系中HCl损伤的BEAS-2B细胞表达E-cadherin在48h有所增加，而α-SMA的表达则受到抑制(P＜0.05);同时U937细胞共培养诱导的羟脯氨酸表达的增加也受到了抑制（P＜0.05）。联合应用CD11a237-246和CD18112-122短肽与单独应用这两个短肽的效果相比差异无统计学意义（P＞0.05）。 结论:HCl刺激可引起肺泡上皮细胞损伤，单核细胞通过直接接触损伤的肺泡上皮细胞，促进肺泡上皮细胞转分化，参与ARDS肺纤维化的发生发展。 第二部分:Ang-(1-7)-Mas受体途径对脂多糖诱导的急性肺损伤小鼠肺纤维化的影响 背景:大约60％的急性呼吸窘迫综合征(acuterespiratorydistresssyndrome，ARDS)患者发生了肺纤维化，且一旦发生肺纤维化，患者预后较差。ARDS时肺组织局部增高的血管紧张素(Ang)Ⅱ促进肺纤维化的发生发展。Ang-(1-7)作为AngⅡ的内源性抑制剂，有可能抑制ARDS肺纤维化。 目的:本研究拟复制小鼠急性肺损伤(acutelunginjury,ALI)模型，外源性给予Ang-(1-7)或Mas受体阻断剂上调或阻断Ang-(1-7)，观察Ang-(1-7)对ALI早期肺纤维化的影响。 方法:雄性C57BL/6小鼠，8～12周龄，随机分为空白对照组、脂多糖(LPS)组、氯沙坦(Losartan，AngⅡ1型受体阻断剂)组、Ang-(1-7)组和A-779(Mas受体阻断剂)组，每组20只。空白对照组小鼠予以气管内滴入与LPS组相等体积的生理盐水，LPS组小鼠气管内滴入LPS(5mg/kg)复制ALI模型，Losartan组小鼠在造模前1d开始经灌胃给予Losartan(10mg/kg·d)，Ang-(1-7)组小鼠在造模前1h予以Ang-(1-7)(100ng/kg·h)持续皮下泵入，A-779组小鼠在造模前1h予以A-779(100ng/kg·h)持续皮下泵入。LPS造模3d或7d后处死动物，留取肺组织待检。肺组织苏木素-伊红(haematoxylinandeosin，HE)染色光镜观察肺组织病理损伤情况、改良Masson法染色明确肺组织纤维化的变化，并测定肺组织湿/干重(wettodryweightratio，W/D)反映肺组织水肿情况，碱水解法检测肺组织羟脯氨酸的含量，免疫组织化学方法分析肺组织Ⅰ型和Ⅲ型胶原的改变情况，WesternBlot方法检测肺组织TGF-β和p-Smad2/3蛋白表达水平的变化。 结果: (1)Ang-(1-7)对肺组织水肿的影响:LPS刺激3d及7d后，LPS组小鼠肺组织W/D均明显高于空白对照组;而Ang-(1-7)组和Losartan组肺组织W/D明显低于LPS组（P＜0.05）。 (2)Ang-(1-7)对肺组织病理损伤的影响:LPS刺激3d及7d后，LPS组肺组织出现肺泡间隔增宽、出血及大量炎性细胞浸润等急性肺损伤病理改变，外源性补充Ang-(1-7)或应用Losartan均可以减轻由LPS所致的肺组织病理损伤，而给予A-779阻断Ang-(1-7)的作用后，肺组织病理损伤较LPS组进一步加重。 (3)Ang-(1-7)对肺纤维化的影响:LPS刺激3d后肺组织胶原纤维增生明显，肺纤维化评分(Ashcroft评分)、羟脯氨酸含量、Ⅰ型和Ⅲ型胶原阳性染色面积均明显高于空白对照组，LPS刺激7d后纤维化的肺组织进一步增加;Ang-(1-7)组和Losartan组小鼠肺纤维化评分、羟脯氨酸含量均较LPS组明显下降（P＜0.05）;而给予A-779后胶原纤维增生更明显，Ashcroft评分、羟脯氨酸含量均明显升高(P＜0.05）。 (4)Ang-(1-7)对促纤维化因子分泌的影响:LPS刺激3d和7d时TGF-β和p-Smad2/3在各组间的差异一致。即LPS组TGF-β和p-Smad2/3蛋白表达水平明显高于空白对照组(P＜0.05);Ang-(1-7)组和Losartan组TGF-β和p-Smad2/3较LPS组显著下降(P＜0.05）;而给予A-779后，TGF-β、p-Smad2/3的表达较LPS组无明显差异（P＞0.05）。 结论:Ang-(1-7)结合Mas受体后通过降低TGF-β和p-Smad2/3的表达抑制ALI肺纤维化。