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肾细胞癌(Renal cell carcinoma,RCC)是常见的恶性肿瘤,约占人类恶性肿瘤的3%,肾细胞癌分四类,肾透明细胞癌(clear cell renal carcinoma,ccRCC),乳头状肾癌(papillary carcinoma)和嫌色肾细胞癌(chromophobe renal carcinoma)。肾透明细胞癌是最常见的,也极具侵略性的肾细胞癌,手术治疗仍是目前最有效的治疗方案,但术后复发的患者约占20%~40%,因此研究肾癌发生发展中的分子水平变化及调控机制,并提供肾癌诊治标志物,意义重大。CRK最初作为一种癌基因产物发现于禽类肉瘤病毒CT10(chicken tumor 10)中,主要由SH2(src homology 2)和SH3(src homology 3)结构域组成。CRK家族包括三个成员:CRKI、CRKII和CRKL,在各个组织中广泛表达。近年来的研究表明:CRKL异常表达与肿瘤生物学行为密切相关,主要通过参与调控细胞骨架重组,信号传导等。然而对于CRKL与肾透明细胞癌(ccRCC)发病机制及可能参与的信号通路的研究仍是一片空白,这值得我们进行探究。MicroRNAs(miRNAs)是一类包含18-24个碱基的高度保守的单链非编码RNA。miRNAs通过与AGO2蛋白结合形成RNA诱导沉默复合体(RNA-induced silencing complex,RISC),进而结合靶基因mRNA的3’-UTR区引发靶基因mRNA降解或抑制其翻译过程。MiR-200家族包括miR-141,200c,200a,200b,和429,这类mi RNA最早被发现参与犬肾细胞的上皮细胞间质化的过程(Epithelial to mesenchymal transition,EMT),后续研究同时发现其在多种癌症中作为肿瘤抑制因子参与调控肿瘤转移。MiR-429作为miR-200家族一员在肾癌中的研究仍然较少,因此针对mir-429进一步探求其可能潜在的其他靶点,深入研究其参与肾透明细胞癌转移的潜在机制。在targetscan,mirdb等生物信息学软件上均发现mir-429与crkl存在靶向关系,因此mir-429与crkl的二者的调控关系在肾透明细胞癌发生发展中的相互作用值得深入探究。目的:1.crkl水平与肾透明细胞癌和786-o细胞的关系探究;2.mir-429水平与肾透明细胞癌和786-o细胞的关系探究;3.明确二者之间的靶向结合以及相互调控关系。方法:1.qrt-pcr和wb检测肾透明细胞癌临床样本中mir-429与crkl的相对表达量;2.利用lipofectaminetm2000介导法转染mir-429mimic/mir-429inhibitor以及阴性对照ncmimic/ncinhibitor,并用qrt-pcr检测转染效率;3.transwell小室测定mir-429表达变化对786-o细胞迁移和侵袭能力的影响;4.利用lipofectaminetm2000介导法转染sir-crkl-pool/pcdh-crkl以及阴性对照sir-nc-pool/pcdh-nc,并用wb检测转染效率;5.transwell小室测定crkl表达变化对786-o细胞迁移和侵袭能力的影响;6.双荧光素酶载体psicheck-mutcrkl-site1、psicheck-mutcrkl-site2、psicheck-wtcrkl-site1、psicheck-wtcrkl-site2及psicheck-wtcrkl-site1+site2构建,并检测mir-429对crkl的靶向作用;7.共转染crklcds区与mir-429检测mir-429是否还能具有调控作用;8.tgf-β诱导实验检测mir-429对内源性crkl调控作用;9.ip和wb检测crkl结合调控蛋白分子;10、鬼笔环肽染色检测细胞骨架构象改变。结果:1.28例肾透明细胞癌临床样本检测中,25例样本的mir-429呈现低表达,23例样本的crkl呈现高表达,二者之间具有负相关的关系;2.qrt-pcr与transwell小室法表明mir-429水平与786-o细胞迁移侵袭能力负相关;3.wb与transwell小室法证明crkl水平与细胞迁移侵袭能力正相关;4.成功构建双荧光素酶载体psicheck-mutcrkl-site1、psicheck-mutcrkl-site2、psicheck-wtcrkl-site1、psicheck-wtcrkl-site2及psicheck-wtcrkl-site1+site2,并测序正确;5.双荧光素酶报告试验检测发现mir-429可以靶向调控crkl3’-utr区;6.共转染crklcds区与mir-429证明mir-429仅调控crkl3’-utr区;7.tgf-β诱导实验发现mir-429能阻断tgf-β对786-o细胞内源性的crkl诱导作用;8.ip实验发现CRKL可以通过和CRKⅡ相互结合作用;9.鬼笔环肽染色发现miR-429增加会减弱细胞骨架的形成。结论:1.miR-429与CRKL的表达关系在肾透明细胞癌样本中呈现负相关;2.miR-429水平与786-O细胞的迁移侵袭能力负相关,CRKL水平与786-O细胞的迁移侵袭能力正相关;3.miR-429能靶向调控CRKL 3’-UTR,并且两个靶向位点中CRKL 3’-UTR 3728-3735区是主要调控位点;4.miR-429能抑制786-O细胞中TGF-β对CRKL的激活以及迁移侵袭能力的促进作用;5.miR-429通过抑制CRKL表达,影响CRKL和CRKⅡ相互结合作用,阻碍细胞的运动能力。