在我国,蘑菇中毒死亡率和病死率均居食物中毒的首位[1]。据中国疾病预防控制中心全国突发公共卫生事件报告管理信息系统显示,2004-2014年我国大陆地区共报告蘑菇中毒病例3701例,死亡786例,病死率高达21.24%[1]。在蘑菇中毒中,约90%的死亡是由含鹅膏毒肽类毒素的蘑菇引起的[2]。鹅膏毒肽类毒素按照氨基酸组成和结构分为鹅膏毒肽(Amatoxins)、鬼笔毒肽(phallotoxins)和毒伞素(Virotoxins)三类,其中最主要的致死毒素是鹅膏毒肽[3]。但目前,关于鹅膏毒肽的研究尚不充分,针对该类毒素中毒治疗的争议大。分析原因,可能主要在于:(1)鹅膏毒肽在多个属的蘑菇中均有发现,而每个属的蘑菇又含有除鹅膏毒肽外的其它毒素,这些毒素间复杂的联合作用带来了临床诊断和鉴别诊断上的困难;(2)毒理学作用机制和路径研究不充分,导致效应靶点选择不明确,非特异性地盲目寻找治疗药物难以起到针对性的治疗效果;(3)缺少源于中毒机制和路径的用于早期诊断的效应生物标志物,临床上通常无法开展快速的鹅膏毒肽中毒诊断。临床常用的肝损伤指标包括谷丙转氨酶(Cereal third transaminase,ALT)、谷草转氨酶(Aspartate aminotransferase,AST)、红细胞血清总胆红素(Totalbilirubin,TBIL)等,但这些指标缺乏特异性,且多在病程的中晚期表现异常,对早期干预意义有限。鉴于此,本研究主要从以下3个方面开展工作:(1)对国内外文献进行系统综述和Meta分析,根据文献对鹅膏毒肽中毒的治疗措施进行分类,对鹅膏毒肽中毒患者的不同临床治疗方法和效果进行系统评估,基于横断面研究的系统文献综述和定量分析可全面揭示鹅膏毒肽中毒治疗的现状和问题并为鹅膏毒肽中毒后现有治疗方式的选择提供证据支持;(2)构建鹅膏毒肽中毒的动物和细胞模型,探讨凋亡(特别是早期凋亡)在鹅膏毒肽诱导的肝损伤中的作用,并研究相关的上下游关键蛋白的变化,进一步补充和完善鹅膏毒肽的体内毒作用链条;(3)应用代谢组学技术,对鹅膏毒肽中毒小鼠的肝脏全代谢谱进行系统分析,筛选并分析不同中毒周期机体的不同表观变化,找出差异代谢物以及相关的富集通路,为临床提供可能的鹅膏毒肽中毒效应标志物,以期做到早诊断早干预、降低含鹅膏毒肽类毒素蘑菇中毒的死亡率。第一部分基于Meta分析的不同治疗方案对鹅膏毒肽中毒的定量疗效评估目的:对鹅膏毒肽中毒患者的不同临床治疗方法及其效果进行评估。方法:检索PubMed、Embase、OVID、万方和中国知网(CNKI),收集整理数据,并对文献进行综述,根据文献对鹅膏毒肽中毒的治疗措施进行分类。同时,根据数据异质性情况,分别采取随机效应模型或固定效应模型进行Meta分析,同步进行偏倚评估和敏感性分析。结果:本研究共检索到文献2659篇,最终纳入Meta分析的文献70篇。模型结果显示,鹅膏毒肽中毒治疗后的总病死率为16.9%,其中亚组α-鹅膏毒肽中毒总病死率为26.3%。在单独一种治疗方式下,鹅膏毒肽中毒治疗后总病死率为21.4%,其中单独支持治疗的病死率(38.4%)明显高于单独药物治疗(8.3%)和单独解毒治疗(14%);在两种治疗方式组合使用后,总病死率为16.8%,其中亚组分析提示支持治疗+药物治疗后的病死率为15.6%,解毒治疗+药物治疗的病死率为16.2%;当解毒治疗、支持治疗和药物治疗联合使用后的总病死率较低,为15.1%。从地理因素看,亚洲患者中毒治疗后的病死率(28.4%)要高于欧洲(12.5%)和北美洲(16.9%)。结论:鹅膏毒肽中毒病死率高,治疗效果不佳,且各大洲之间存在明显差异。药物、解毒和支持治疗联合应用治疗效果最好。第二部分ROS/p53介导的线粒体凋亡途径是α-鹅膏毒肽所致肝损伤的早期事件目的:α-鹅膏毒肽被认为是鹅膏毒肽最主要组分,本部分主要探讨凋亡在α-鹅膏毒肽诱导的肝损伤中的作用以及上游激活信号。方法:BALB/c小鼠被随机分为3个剂量组(0、0.23和0.35 mg/kg),每组6只。首先通过TdT介导的dUTP缺口末端标记(TUNEL)法观察α-鹅膏毒肽中毒小鼠在不同时间段(4、8、12、24、48和72h)的整体死亡和损伤情况。然后评估小鼠肝组织中氧化酶和抗氧化酶,包括过氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、过氧化氢酶(catalase,CAT)和丙二醛(malondialdehyde,MDA)的活性以及参与凋亡的相关蛋白质的表达情况(细胞色素C,Caspase 8,Caspase 9和Caspase 3)。体外模型中,在不同时间点(6、12、24和36h),用梯度浓度(0、2和5μM)的α-鹅膏毒肽对L-02细胞进行染毒。分别通过相差显微镜、细胞增殖/毒性试剂盒(CCK-8)和FITC膜联蛋白V+7-AAD凋亡检测试剂盒观察和检测染毒的L-02细胞的死亡和凋亡情况;并用免疫印迹分析(Western Blotting,WB)检测p53蛋白和线粒体凋亡途径下游相关蛋白(细胞色素C、Bax、Bcl-2、Cleaved-Caspase 9和Cleaved-Caspase 3)的表达水平;接着通过检测细胞间总活性氧(Intercellular total reactive oxygen species,ROS)以及线粒体活性氧(Mitochondrial reactive oxygen species,mtROS)水平,分析氧化损伤与α-鹅膏毒肽所致肝细胞凋亡的关系;最后,使用标准抗氧化剂N-乙酰-L-半胱氨酸(NAC)从侧面验证活性氧在α-鹅膏毒肽诱导的L-02细胞毒性中的作用。结果:1.α-鹅膏毒肽对小鼠肝组织和L-02细胞均造成损伤染毒小鼠出现明显的中毒表现,并且大部分在中毒72h以后死亡;另外,随着α-鹅膏毒肽染毒浓度的增加和(或)处理时间的延长,肝细胞(L-02细胞)的生长受到明显的抑制,显微镜下肝细胞生长密度显著下降,并最终死亡。0.23 mg/kg和0.35 mg/kg是理想的动物模型浓度,2 μM和5 μM是理想的细胞模型浓度。2.α-鹅膏毒肽通过线粒体凋亡途径诱导肝细胞凋亡α-鹅膏毒肽可通过诱导细胞凋亡导致肝脏损伤,并且α-鹅膏毒肽诱导的细胞凋亡主要通过线粒体凋亡途径发生。α-鹅膏毒肽染毒后小鼠肝脏组织(TUNEL染色)以及L-02细胞(FITC膜联蛋白V+7-AAD凋亡检测试剂盒)凋亡细胞数量增多,与对照组相比差异显著(P<0.05)。线粒体凋亡通路蛋白水平也发生改变,包括细胞色素C、Caspase-9、激活态的Caspase-3以及促凋亡蛋白的表达(如phosph-p53和Bax)的显著增加(P<0.05),和抗凋亡蛋白(Bcl-2)的表达减少(P<0.05)。3.氧化应激可能是α-鹅膏毒肽所致肝细胞凋亡的早期生物学事件随着α-鹅膏毒肽染毒时间的延长(4,8,12,24,48和72h),ROS、SOD和CAT的活性逐渐降低,氧化应激产物特别是MDA的活性显著升高,各时间点染毒组与对照组相比,差异均有显著性(P<0.05)。染毒细胞总ROS以及mt-ROS显著增加,提示氧化损伤在中毒机制中的重要作用。添加ROS抑制剂后中毒指标(细胞存活率、细胞凋亡情况以及线粒体凋亡途径相关蛋白水平的改变)的逆转也证实了这一结论。结论:α-鹅膏毒肽可触发细胞的凋亡过程,包括改变p53和Bax、Bcl-2的蛋白表达水平,从而激活线粒体凋亡途径相关Caspase级联反应。ROS作为一种上游信号分子,参与α-鹅膏毒肽诱导的细胞凋亡。第三部分线粒体功能障碍引起的能量失衡是导致α-鹅膏毒肽所致肝损伤的主要原因目的:在第二部分的研究过程中,发现染毒后肝脏组织出现广泛的中央小叶坏死区,且肝细胞炎性浸润情况严重。对肝细胞死亡机制的探索中,研究又发现细胞坏死在染毒后期占据主要原因,提示凋亡的研究不足以作为主因解释α-鹅膏毒肽所致肝损伤,需要进一步的深入挖掘与探索。作为人体内最为重要的代谢器官之一,肝脏损伤会引起全身性的代谢变化。因此研究肝脏的损伤机制时,不能仅关注肝细胞本身,要了解体内各种代谢产物在疾病发生、发展过程中的变化规律。故本部分研究利用代谢组学技术对α-鹅膏毒肽染毒小鼠肝脏进行全代谢谱分析,寻找差异代谢物及其所在富集通路的同时,从点到面探索可能的损伤途径及损伤的剂量-效应和时间-效应趋势,并通过分子生物学试验加以验证,从而补充完善所涉及的路径,构建调控网路。方法:本部分研究分别从体内动物和体外细胞两个研究层面入手,筛选并验证了α-鹅膏毒肽所致肝损伤乃至肝衰竭的可能作用通路。1.在通过肝脏生化酶指标和细胞存活率等指标确定构建的细胞和动物模型成功后,首先用免疫组化法和免疫印迹法观察了肝损伤过程中的炎症浸润标志蛋白(包括NF-κB p65,磷酸化NF-κB p65,IKBα和磷酸化IKBα等蛋白)的表达并用坏死相关试剂盒通过流式细胞仪分析了细胞的坏死情况。2.建立以气相色谱-飞行时间质谱联用(gas chromatography-time-of-flight mass spectrometer,GC-TOF/MS)技术为基础的α-鹅膏毒肽中毒小鼠肝脏代谢组学研究模型,分析α-鹅膏毒肽对肝脏代谢谱的影响,结合单因素及多元统计分析方法,并比对专业标准品数据库,筛选和鉴定出差异代谢产物,最后通过通路富集找出目标代谢通路。然后根据GC-TOF/MS结果提供的相关线索,结合分子生物学技术对差异代谢通路进行验证和深入研究。结果:1.肝细胞坏死和继发反应是α-鹅膏毒肽引起死亡的重要原因与前一部分试验结果相似,染毒小鼠出现明显中毒表现,染毒细胞出现明显存活率降低表现。同时,根据流式细胞仪分析结果,α-鹅膏毒肽染毒后,细胞主要处于坏死或凋亡晚期。与对照组相比,α-鹅膏毒肽染毒组的细胞坏死率从24h开始显著增加(P<0.05)。免疫组织化学试验结果显示,与对照组相比,α-鹅膏毒肽染毒组肝细胞NF-κB阳性染色明显增加(P<0.05),表明细胞核中活化的NF-κB的显著增多,且该趋势具有时间依赖性。同样地,在免疫印迹试验中,与对照组相比,α-鹅膏毒肽染毒组的NF-κB和下游蛋白IκB-α的磷酸化水平随时间显著升高(P<0.05)。2.α-鹅膏毒肽对肝组织代谢谱的影响2.1 总体情况分析对所有分组进行总体研究,通过主成分分析(Principal components analysis,PCA)和偏最小二乘判别分析(partial least-squares discrimination analysis,PLS-DA)模型,研究发现早期小鼠肝脏小分子代谢物的变化主要集中在α-鹅膏毒肽染毒后8h到12h,而在染毒48h之后,小鼠肝脏经历了第二阶段的变化。2.2 α-鹅膏毒肽染毒小鼠肝脏潜在效应生物标志物及其相关网络分析1)α-鹅膏毒肽染毒小鼠模型的肝脏全代谢谱分析结果显示,在8h、12h和48h时染毒组与对照组的代谢产物存在显著差异。2)在α-鹅膏毒肽染毒后8h-12h期间,小鼠肝脏发生了第一阶段的变化。代谢途径富集分析(MPEA)显示淀粉和蔗糖代谢、泛酸和辅酶a生物合成以及精氨酸生物合成三个途径上的代谢产物发生了显著变化。筛选出D-葡萄糖、D-麦芽糖、葡萄糖6-磷酸酯、异麦芽糖、海藻糖、α-酮戊二酸、鸟氨酸、β-丙氨酸、泛酸、L-天冬氨酸、L-半胱氨酸、富马酸和N-乙酰谷氨酸为参与该途径的高度显著化合物,与对照组相比,染毒组13种代谢物的含量均发生显著变化(P<0.05)。然后观察了小鼠在暴露于α-鹅膏毒肽48h后的新变化。除了前面提到的淀粉和蔗糖代谢以及精氨酸生物合成外,柠檬酸循环(TCA循环)和半乳糖代谢也发生了显著变化。同样,在这两个途径中筛选了新出现的高丰度代谢物,包括柠檬酸、异柠檬酸、α-酮戊二酸、丙酮酸和D-半乳糖等(与对照组相比,P<0.05)。3.线粒体功能障碍是α-鹅膏毒肽引起肝细胞坏死的重要原因代谢组学的结果和对细胞死亡机制的探索表明,线粒体功能障碍可能是α-鹅膏毒肽引起肝细胞损伤和肝衰竭的主要原因。线粒体功能障碍可能涉及的途径包括:抑制呼吸链导致三磷酸腺苷(adenosine triphosphate,ATP)耗竭,线粒体氧化应激增加、线粒体通透性转变(MPT)导致的肝细胞坏死等。因此,本部分研究检测了线粒体过渡孔的通透性(mPTP),细胞内ATP水平,mtROS的生成,并使用 JC-1 量化了线粒体膜电位(Mitochondrial membrane potential,△ψm),从侧面反映了 mPTP的开放程度。结果显示,α-鹅膏毒肽显着降低了△ψm,同时导致mPTP通透性增加、ATP降低以及mtROS升高,与对照组相比差异均有显著性(P<0.05)。而且所有结果均与时间有关,尤其是24h后变化更为明显。结论:α-鹅膏毒肽染毒小鼠肝脏代谢异常,提示淀粉和蔗糖代谢、泛酸和辅酶a生物合成、精氨酸生物合成以及柠檬酸循环(TCA循环)四个途径上的代谢产物发生了显著变化。线粒体功能障碍可能是α-鹅膏毒肽诱导的肝脏代谢紊乱以及肝细胞坏死的主要原因。