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目的:GPR50（G Protein Couple-Receptors 50,G蛋白偶联受体50）作为G蛋白偶联受体家族成员,在中枢神经系统中各脑区广泛表达,参与下HPA轴正常功能（Hypothalamic-Pituitary-Adrenal axis,丘脑-垂体-肾上腺轴）以及GR（Glucocorticoid Receptors,糖皮质激素受体）信号传导,可作为情绪以及情感的潜在调控分子存在,但其详细功能以及作用机制尚未被阐明。我们前期结果发现GPR50基因缺失影响GRs磷酸化的激活和转录活性,进而干扰单胺递质水平及其受体的表达。本实验旨在探讨GPR50分子在急性应激反应中的变化及作用,验证GPR50对神经递质分子表达调节的详细分子机制,以期为GPR50作为应激相关精神疾病的潜在药物靶点提供理论基础和实验依据。方法:设计野生小鼠建立时间梯度（0至210分钟设置时间间隔为30分钟）的急性束缚应激模型,确定急性束缚应激模型的有效时长以及GPR50在其间起到的作用。选择合适束缚时间,应用GPR50敲除鼠建立急性应激模型。我们检测动物行为学变化（旷场实验和避暗实验）、评估GR、磷酸化GR（S211）及单胺类递质受体(5-HT1aR、DRD1、DRD2)以及脑源神经生长因子（BDNF）表达的变化。另通过体外细胞系实验干预GPR50和GR分子的表达以及活性,结合相关药物具体分析GPR50调控急性应激的分子机制。结果1.急性束缚应激模型GPR50表达上调急性束缚应激（ARS）明显增加海马脑区GPR50的蛋白表达,在束缚2小时表达量达到顶峰,其差异具有统计学意义（p＜0.05）,提示急性应激模型最佳时间点是2小时。2.GPR50基因缺失对急性束缚应激模型小鼠的影响2.1 GPR50敲除鼠ARS造模后行为学变化（1）旷场实验结果,20周龄的野生鼠急性束缚应激组与同龄野生鼠对照组相比较,水平活动的距离（p＜0.05）以及中心区域出现次数（p＜0.05）增加,表现为增加的活跃度,探索时间没有明显差异。20周龄雄性GPR50敲除鼠(GPR50-/Y)与野生型对照组相比,水平运动距离也增加（p＜0.05）,但是在中心区域存留时间缩短（p＜0.05）,进入中央区域次数减少（p＜0.05）;GPR50敲除鼠急性束缚应激组与对照组相比较水平活动距离减少,但差异没有统计学意义（p=0.102）,在中心区域出现次数增加（p＜0.05）。（2）避暗实验结果显示,20周龄的野生型小鼠急性束缚应激造模后,进入暗箱前的潜伏期明显加长（p＜0.05）、次数明显减少（p＜0.05）、停留时间减少（P＜0.05）。GPR50敲除鼠(GPR50-/Y)与野生对照组相比,潜伏期缩短（p＜0.05）,停留时间延长（p＜0.05）,但是进入次数没有明显差别。在基因敲除鼠与基因敲除应激组比较,潜伏期,存留时间以及出入次数都没有明显。上述结果表明急性束缚应激模型可以降低小鼠的焦虑情绪,增加自身活跃度,增强恐惧记忆以帮助野生小鼠规避伤害;但是对于GPR50敲除鼠来讲,本身表现出焦虑且适应性反应异常。2.2 GPR50敲除鼠ARS造模后,血液和脑内GR及与情感相关的递质及受体的变化（1）GPR50敲除鼠与正常对照组比较,海马内S211（Ser211位点磷酸化的GR）,DRD1,DRD2（多巴胺受体1、2）,5-HT1a R和BDNF蛋白表达明显降低（p＜0.05）;野生型ARS模型组与野生型对照组相比,海马内S211、DRD1、DRD2、5-HT1a R和BDNF蛋白水平明显升高（p＜0.05）;GPR50敲除鼠ARS模型组与其对照组相比较,海马内S211,DRD1,DRD2,5-HT1a R和BDNF变化无统计学差异。（2）GPR50敲除鼠血液中S211较正对照组相比明显降低（p＜0.05）;野生型ARS模型组血液内S211较野生对照组明显升高（p＜0.05）;而GPR50敲除鼠ARS模型组较敲除对照组相比,血液中S211变化无统计学差异。3.体外实验研究GPR50对GR转录活性的调控机制3.1 GR拮抗剂米非司酮（RU-486）可抑制GPR50过表达诱发的相关分子的激活（1）与对照组相比,过表达GPR50可上调211位点磷酸化的GR的蛋白表达（p＜0.05）,有下调226位点磷酸化的GR分子表达的趋势但无统计学意义。正常对照组加入RU486后,S211分子蛋白表达量明显降低（p＜0.05）,而GPR50过表达组加入RU486后S211表达水平明显降低（p＜0.05）。（2）GPR50过表达组与对照组相比,DRD1和DRD2表达均明显增加（p＜0.05）,给予RU-486后,GPR50过表达组DRD1,DRD2,BDNF和S211表达水平明显降低（p＜0.05）。3.2 GR受体激动剂地塞米松（DXMS）不能改善GPR50敲减（sh GPR50）对GR转录活性的抑制。正常对照组给予GR受体激动剂DXMS后,DRD1、DRD2、BDNF、5-HT1aR和S211的表达明显增加（p＜0.05）。下调GPR50后,sh GPR50组DRD1、DRD2、BDNF、5-HT1aR和S211表达水平明显降低（p＜0.05）,给予DXMS后,与sh GPR50组相比,sh GPR50+DXMS组DRD2,5-HT1aR,DRD1以及BDNF,S211变化无统计学差异。3.3过表达GR不能改善下调GPR50诱发的转录抑制（1）与空载质粒对照组（NC）相比,过表达GR组S211（p＜0.05）,DRD1（p＜0.01）和BDNF（p＜0.05）明显增加。（2）与敲低GPR50组相比,（过表达GR与敲低GPR50）共转染组GR P S211和DRD1变化无统计学差异。3.4胞浆内过表达GPR50提高S211的水平,过表达GPR50提高胞浆内S211表达（1）与对照组相比,过表达GPR50明显升高胞浆或全细胞内S211表达量（p＜0.05）;而核内S211无明显变化。（2）免疫荧光染色证明与对照组相比,GPR50过表达组胞浆以及胞核内S211（p＜0.05）表达水平均明显升高。分别过表达全长GPR50、C端GPR50、N端GPR50三种质粒（3）过表达N端GPR50片段组与NC对照组相比,S211表达明显升高（p＜0.05）;过表达C端GPR50片段组与NC对照组相比,S211变化无统计学差异。C端GPR50分子不进入细胞核而是在胞浆中发挥作用,因此从侧面提示作用GR的原理不是通过直接提高GR核表达量。3.5转入S211位点突变的GR过表达质粒(OE-GRMS211)不能阻断过表达GPR50对GR转录活性的调控（1）与NC组相比,OE-GRMS211组的S211,DRD1,BDNF表达量无明显变化。（2）与OE-GRMS211组相比,(OE-GRMS211＆OE-GPR50)共转染组的S211（p＜0.05）、DRD1、BDNF有明显提高（p＜0.05）。3.6 GPR50通过影响CDK5复合激酶调控GR磷酸化。SY5Y细胞系过表达GPR50,分组加入p38MAPK抑制剂SB203580和CDK5抑制剂Roscovitine。（1）与OE-GPR50组相比,OE-GPR50+SB203580组S211、DRD1、BDNF变化无统计学差异,（2）与OE-GPR50组相比,OE-GPR50+Roscovitine组S211、DRD1、BDNF明显降低（p＜0.05）。以上结果表明,GR抑制剂可阻断GPR50的转录激活作用,GR激动剂和过表达GR均不能缓解GPR50缺失对转录的抑制作用,提示GPR50可能在GR的上游对GR的转录活性起调控作用,其中S211的相应变化以及过表达GPR50对GR的调控主要发生在胞浆提示,GPR50主要通过影响GR胞浆的磷酸化修饰,来调控转录活性。GPR50可能通过CDK复合体调控GR磷酸化增加S211的表达量从而影响应激反应。结论:（1）ARS模型可以增加野生型鼠的活跃度和恐惧记忆形成,提高野生小鼠血液和脑内S211及下游分子的表达。（2）GPR50参与急性应激反应的调节,GPR50缺失阻断ARS的激活作用,导致GPR50敲除鼠存在焦虑样行为和认知功能下降,容易发生应激反应障碍。（3）GPR50分子主要调控GR磷酸化影响HPA系统以及神经递质分子（4）GPR50可能通过CDK复合体调控GR磷酸化增加S211的表达量从而影响应激反应。