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作为遗传信息的携带者,核酸参与指导生命活动机能运作,在生物学、生物化学、医学等领域发挥着重要的作用。核酸组成、序列和构型的多样性造成了其结构的复杂性,核酸分子的化学性质和结构特征决定了它们的生物功能。人类基因工程以及基于反义寡核苷酸的新颖治疗药物的快速发展激励人们寻找并开发用于核酸分离分析的快速方法。然而,核酸的大尺寸以及超常的形态易变性使其分离面临着极大的挑战。高效液相色谱(HPLC)由于分离度高、循环时间短、全部自动化等特点成为人们常用的分离技术,在核酸分离分析中广泛应用。核酸分子的结构特征能够体现在色谱行为方面,反之,色谱行为也可以揭示相关的结构信息。本文采用反相液相色谱(RPLC)为主要分析手段,考察碱基组成、序列、二级结构、色谱固定相、流动相等对核酸保留的影响,探索核酸结构—保留行为关系,探讨核酸分子与RPLC固定相之间的作用机理,研究核酸在溶液中的存在状态和结构行为。本文研究内容主要包括:(1)利用离子对反相液相色谱(IP-RPLC)在硅胶基质的C18固定相上对寡核苷酸和双链DNA的保留行为进行研究。研究发现寡核苷酸的保留同时受到碱基组成和碱基序列的影响,而非单纯的尺寸控制。而且,倾向于形成自身二聚体的寡核苷酸的保留比相同碱基组成不易形成自身二聚体的寡核苷酸保留弱。但是,同型寡核苷酸作为特例,其分离主要受尺寸控制。对于双链DNA,保留不仅与尺寸相关,也与碱基组成和碱基序列相关。我们推测这与DNA大沟和小沟中暴露的碱基有关,暴露的碱基可以与固定相上的烷基链发生疏水作用。此外,鸟嘌呤和胞嘧啶的含量对双链DNA的保留特征没有明显影响。值得注意的是,核酸立体结构造成的空间位阻也是影响核酸IP-RPLC保留行为的因素之一。(2)分别使用硅胶基质C18整体柱和硅胶基质C18填充柱,采用IP-RPLC对寡核苷酸在不同柱温下的保留行为进行考察。结果显示,在整体柱上发卡结构寡核苷酸的保留均比相应线性结构寡核苷酸的保留弱。然而,在填充柱上,两者之间的出峰顺序却无规律可遵循。此外,整体柱上,寡核苷酸保留因子(k)与柱温倒数(1/T)之间具有良好的线性相关性,可用于不同柱温下的保留预测。在填充柱上,k与1/T的相关性不如整体柱,且填料粒径越小相关性越差,其中发卡结构的相关性总是差于相应线性结构。研究同时发现,小粒径(3 μm)填充柱上的整体保留顺序与整体柱相差甚远,而大粒径(10 μm)填充柱上的总体保留顺序与整体柱趋于一致。基于以上保留特点,我们推测,由于整体柱特殊的孔结构及其分布特点,寡核苷酸可以保持其初始状态下的构型顺利通过整体柱,保留规律易于归纳。而在填充柱中,由于固定相填料颗粒之间的通道狭窄、曲折,寡核苷酸分子通过时构型受到抑制甚至改变,导致保留行为更加复杂,保留规律难以总结。因此,硅胶基质整体柱在研究寡核苷酸保留规律时优于填充柱,基于整体柱的分离,为准确评估寡核苷酸的IP-RPLC保留行为开辟了诱人的前景。(3)利用IP-RPLC对寡核苷酸在混合离子对试剂三乙胺/丙胺-乙酸盐(TEA/PA-AA)体系下的保留行为进行研究,并与经典离子对试剂三乙胺乙酸盐(TEAA)体系下的保留行为进行对比。实验发现,在相同的离子对试剂浓度下,寡核苷酸在TEA/PA-AA体系下的保留均弱于TEAA体系下的保留,且寡核苷酸的保留均随离子对试剂浓度(20-120mM)的增加而增强。同型寡核苷酸(dC)n作为特例,当n>10时,保留基本趋于稳定,这是由于(dC)n随离子对试剂浓度的增加保留增长较快,在较低的离子对试剂浓度下即可达到最大保留。同时发现,短链同型寡核苷酸(dT)n和异型寡核苷酸在TEA/PA-AA体系下的分离均优于TEAA体系,而同型寡核苷酸(dA)n和(dC)n的分离则在TEAA体系下更优。通过流动相中离子对试剂总浓度(Cp)和寡核苷酸kk之间的关系,我们推导出两种体系下寡核苷酸的保留机理均以离子对模型占主导地位。总体而言,在分离长度相同、结构相近的异型寡核苷酸时,TEA/PA-AA混合离子对体系尤其在中等离子对浓度下比TEAA体系具有明显优势,低的离子对试剂浓度可增加与后续电喷雾质谱(ESI-MS)的兼容性,有利于寡核苷酸的定性分析。(4)采用RPLC、液相色谱-质谱联用(LC-MS)技术结合荧光光谱、圆二色谱以及非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳对三种不同序列d[(G3T)3G3]、d[(G3C)3G3]和d[(G3T)4]在六种不同退火溶液下的G-四链体多态性进行了考察。三种序列的G-四链体形态均可使用RPLC进行有效分离,使用LC-MS进行在线结构表征。结果揭示,在实验的退火环境下,d[(G3T)3G3]和d[(G3C)3G3]倾向于形成高级G-四链体结构而非分子内G-四链体。然而,侧环阻碍了 d[(G3T)4]形成除二聚体之外的高级结构。此外,阳离子的性质和浓度以及退火缓冲溶液的组成都会影响G-四链体的稳定性和相对比例。综上,RPLC、LC-MS结合光谱和电泳技术可以作为快速分离并鉴别溶液中G-四链体的一种温和、有力的工具,可有效用于评估DNA序列和退火环境对G-四链体多态性的影响。建立的分析方法为G-四链体多态性的评估提供了一种新策略,有利于阐明G-四链体的结构及其生理功能。本文的研究有助于核酸色谱分离体系的选择,从而有助于核酸的分离、纯化、表征和定量,并可用于揭示核酸在溶液中的存在状态,促进核酸结构及生物物理性质的研究。