蜕皮是甲壳动物生长发育中重要的生物学现象。蜕皮周期中的离子转运对甲壳动物生长、存活和繁殖都具有重要的生理学意义。然而目前关于甲壳动物蜕皮周期中离子转运的分子机制仍然不明确。本文以拟穴青蟹为研究对象,依据第三颚足上刚毛的形态变化,将拟穴青蟹蜕皮周期准确划分为蜕皮后期、蜕皮间期、蜕皮前期和蜕皮期。通过电镜、HE染色等方法,分析了拟穴青蟹离子转运的主要器官——鳃的形态学结构特征。通过分子生物学方法,发现拟穴青蟹肝胰腺中,钙网蛋白(CRT)在蜕壳周期中的基因表达量变化与钙含量的变化趋势具有相似性,说明钙网蛋白可能参与肝胰腺中钙离子的存储过程;同时发现,拟穴青蟹血淋巴中的Na+、Cl-浓度以及渗透压变化规律与Na+/K+/2Cl-共转运蛋白(NKCC)的基因表达量变化一致,说明它可能参与蜕皮后期渗透压调节中的离子吸收过程。该研究为深入解析甲壳动物蜕皮周期中离子转运的相关机制打下了良好基础。具体研究结果如下:1.拟穴青蟹蜕皮周期的划分采用拟穴青蟹第三颚足的刚毛发育和游泳足内皮发育的形态学特征对其蜕皮周期的划分进行了研究。结果显示,采用第三颚足可以将蜕皮周期划分为:蜕皮后期A期、B期;蜕皮间期为C期;蜕皮前期被细分为D0亚期、D1亚期、D2亚期;蜕皮期E期。采用游泳足也可以将其划分为几个类似的蜕皮时期。但是由于拟穴青蟹游泳足较厚,透明度较差,不能精确地对蜕皮周期进行划分。因此,采用第三颚足的刚毛发育的分期方法更加清晰、精确。2.拟穴青蟹鳃的结构结合运用扫描电镜,透射电镜以及HE染色技术,对拟穴青蟹的离子转运的器官-鳃的结构进行了形态学分析。结果表明,拟穴青蟹具有8对鳃,每条鳃由中心鳃轴及其向两侧的层片状鳃叶组成,鳃叶之间具有囊状结构,可能起到支撑和控制鳃间距的功能。鳃壁外被角质层,内由上皮细胞、隔膜和中央血腔构成。切片结果显示:前鳃中,上皮细胞主要以薄细胞为主,中央血腔相对较大,细胞内线粒体和膜结构相对较少,为鳃的呼吸型上皮;而后鳃中厚细胞居多,细胞内含有丰富的膜结构和线粒体,从而分别为离子转运提供酶的着位点和能量,因而更有利于离子的主动转运和物质的吸收,为离子型上皮。因此,拟穴青蟹的前鳃主要参与呼吸作用,而后鳃则在离子转运中具有重要的作用。3.外壳在拟穴青蟹蜕皮过程中的矿化过程应用扫描电镜对拟穴青蟹不同蜕皮时期(A期、C期、D期、E期)的外壳截面进行扫描。结果显示:拟穴青蟹外壳在蜕皮后期A具有上表皮、外表皮和内表皮。进入蜕皮间期C,表皮最内层的膜层形成,具备完整的表皮结构,厚度增加。到了蜕皮前期,表皮厚度继续增加,膜层消失。蜕皮期丢弃的外壳,厚度和蜕皮前期相近,但上皮层消失。在外壳中主要含有C(40.91%)、O(36.59%)、Ca(12.58%)、P(7.60%)几种元素,其他还含有少量的Si、P、S、Mg、Na等元素。说明了拟穴青蟹的外壳中可能主要以碳酸钙和磷酸钙盐为主。在不同的蜕皮时期内,钙的相对含量发生周期性变化,蜕皮后期,外壳钙浓度最低(0.42%);蜕皮间期完成矿化后,钙浓度上升到13.94%;蜕皮前期,外壳中钙浓度达到21.35%;蜕皮期达到最大值为29.75%。证明了拟穴青蟹外壳的钙离子随着蜕皮周期而逐渐累积,使得其外壳的厚度和机械强度增加。蜕皮时,拟穴青蟹丢失大部分钙,随后的矿化过程则需要迅速补充大量的钙。4.钙网蛋白在拟穴青蟹蜕皮周期中钙代谢的调节作用应用同源克隆策略和RACE技术从拟穴青蟹克隆了钙网蛋白CRT基因,经实时荧光定量PCR检测,CRT基因在拟穴青蟹的肌肉、鳃、肝脏、触角腺、胸神经节、心脏、肠、上皮等8个组织中均表达,说明其参与拟穴青蟹多种生理功能的调节,但表达量有显著差异,其中在肝胰腺中表达量远高于心脏和肠等组织。在不同的蜕皮周期内,原子吸收光谱和焦锑酸钾沉淀法结果显示:肝胰腺的钙离子在蜕皮后迅速降低,蜕皮间期保持平衡,蜕皮前期存储量增加,这和CRT mRNA在不同蜕皮时期的表达量具有一定的一致性。上述试验结果表明,CRT基因可能参与肝胰腺中Ca2+的储存过程。5.NKCC在拟穴青蟹蜕皮周期中渗透压的调节功能应用同源克隆策略和RACE技术,从拟穴青蟹鳃中成功克隆得到Na+/K+/2Cl-共转运蛋白(NKCC)基因。NKCC基因全长4151bp,编码1053个氨基酸,组织分布的结果表明SpNKCC mRNA主要在鳃组织中集中表达,尤其是参与离子转运的后鳃中表达量最高。在蜕皮周期中,血淋巴渗透压,Na+、Cl-在蜕皮期最低,蜕皮后期(A-B)迅速增加,随后间期达到平衡,在蜕皮前期又进一步升高。蜕皮SpNKCC mRNA在蜕皮后期的离子吸收的时期表达量迅速增加,同时和许多参与离子吸收的基因表达量一致,说明了后鳃的SpNKCC参与了蜕皮后期的离子平衡时的离子吸收。