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胚胎干细胞(ESC)诱导分化为神经细胞的体外模型类似早期的胚胎发育模式,利用此模型,辅之以分子生物学、细胞生物学及免疫学等技术手段,可以有效进行神经发生分化及一些遗传性神经致病机制的研究。胚体(EBs)是ESC分化前形成的团聚体,在ESC神经分化过程中具有承前启后的作用,EBs内细胞的周期状态与诱导分化的关系未见报道。无血清培养方法诱导神经分化过程中,碱性成纤维生长因子(bFGF)是EBs贴壁后诱导分化阶段必须添加的生长因子,bFGF可能在ESC神经诱导分化阶段发挥神经营养作用,但由于bFGF能触发体外培养的皮层神经元释放兴奋性递质谷氨酸(Glu),故也可能在神经诱导分化阶段发挥神经刺激兴奋性的作用。利用ESC诱导分化为神经细胞的体外模型可以从神经发育学的角度分析阿尔茨海默症(AD)的发生机制,尤其是神经元从分化发生到凋亡或死亡的发育模式,为我们在体外研究β-淀粉样蛋白(Aβ)对不同年龄阶段神经元的影响提供了可能。 首先,建立了基于本实验室条件下的ESC诱导分化神经元细胞方法体系。我们在Bain“4+/4-”RA诱导法的基础上,对小鼠D3系ESC采用“2+2”(即悬滴培养2天再悬浮培养两天)的培养方式形成EBs,全反式维甲酸(RA)诱导的ESC在体外分化为神经元样细胞,并初步分析了ESC诱导分化的神经元细胞生物学特性。结果发现,我们诱导ESC分化产生了谷氨酸能的神经元细胞,通过RT-PCR分析鉴定,这类神经元细胞表达了NMDA受体亚型;使用荧光分子探针标记发现,分化的神经元细胞能够被Glu刺激后开放NMDA受体通道,使胞内钙离子浓度升高,并被NMDA受体拮抗剂MK801阻断。 其次,通过探索不同周期时相ESC对EBs形成的影响、不同增殖状态ESC对神经分化的影响等,确立ESC的细胞周期状态与EBs的结构形成的关系,发现血清饥饿同步化可以增强EBs的分化潜能性。通过血清饥饿、脱氧胸苷和秋水仙素阻断法分别有效地将ESC阻断在G0/G1、G1/S、G2/M相,研究了同步化后的细