论文部分内容阅读
目的:
1.在正常培养C2C12骨骼肌细胞的基础上,模拟胰岛素抵抗患者体内脂质浸润的特点,建立胰岛素抵抗骨骼肌细胞模型。
2.观测正常培养状态下以及棕榈酸(Palmitate)造成胰岛素抵抗状态下,中药提取物蒲黄总黄酮(PTF)对骨骼肌细胞葡萄糖消耗和葡萄糖摄取的影响,了解PTF有无促进葡萄糖代谢和改善胰岛素抵抗的作用。
3.进一步观察PTF对胰岛素抵抗细胞模型白细胞介素6(IL-6)表达的影响,探讨其改善骨骼肌胰岛素抵抗的可能作用机制,为深入探讨PTF改善胰岛素抵抗的细胞分子机制提供实验依据。
方法:在Palmitate培养环境下,以3H-葡萄糖摄取试验为标准建立IR骨骼肌细胞模型;XTT比色法观察药物对细胞活性的影响；Real—time PCR检测IL-6mRNA的表达；酶联免疫检测法(ELISA)检测细胞培养上清中IL-6的蛋白含量。
结果:
1.胰岛素抵抗骨骼肌细胞模型的建立;0.25mmol/L棕榈酸(Palmitate)培养C2C12骨骼肌细胞16h,结果显示palmitate培养下的C2C12骨骼肌细胞葡萄糖转运率下降30.43％,与正常对照组比较,差异有统计学意义,胰岛素抵抗骨骼肌细胞模型建立。
2.PTF对C2C12骨骼肌细胞葡萄糖代谢的影响葡萄糖消耗试验检测PTF对C2C12骨骼肌细胞葡萄糖的消耗及细胞活力的影响:XTT结果显示,培养液中加入的PTF浓度为0.125～1.0g/L时,细胞活性未受明显影响,但当浓度达到2.0 g/L时,XTT的OD值明显下降:0.5g/L PTF干预正常C2C12骨骼肌细胞3h、6h、12h、16h、24h,发现其均可促进葡萄糖消耗,且呈一定的时间依赖效应,罗格列酮(ROS)(5μmol/L)与PTF相比,促进葡萄糖消耗的能力更为明显；0.25mmol/L Palmitate培养C2C12骨骼肌细胞,加不同浓度的PTF(0.125～2.0 g/L)和ROS(5μmol/L)干预16h,结果显示:与正常组相比,模型组葡萄糖消耗量下降34.66％；而当PTF浓度为0.25～1.0g/L时,葡萄糖消耗量增加,与模型组相比,分别增加了25.22％,50.43％,75.65％,差异有统计学意义,当PTF浓度为0.125 g/L和2.0 g/L时,差别无统计学意义。ROS组与0.25g/L、0.5g/L PTF组相比,差异有统计学意义。
3H-葡萄糖的摄取试验检测PTF对C2C12骨骼肌细胞葡萄糖摄取的影响PTF可促进胰岛素抵抗的C2C12骨骼肌细胞3H-葡萄糖摄取。0.5 g/L的PTF葡萄糖转运率为模型组的132.39％,5μmol/L ROS葡萄糖转运率为模型组的145.88％,与模型组相比均有统计学差异；PTF与ROS组相比,差异无统计学意义。
加入核转录因子κB(NF-κB)阻滞剂--pyrrolidine dithiocarbamate(PDTC)后,再次检测各组细胞对葡萄糖的摄取,结果表明:模型组葡萄糖转运率与未加之前相比提高了32.40％,PTF组、ROS组的葡萄糖转运率与未加PDTC之前相比,分别提高了47.46％和26.26％。
3.PTF对骨骼肌细胞白细胞介素6(IL-6)mRNA表达的影响Real-time PCR结果显示:Palmitate培养条件下,模型组IL-6 mRNA表达明显增强,是正常对照组的3.5倍；加入NF-κB抑制剂PDTC后,模型组IL-6 mRNA表达下调；加入PTF和ROS后,IL-6 mRNA的表达受到明显抑制；而在加入PDTC后,PTF和ROS组又分别使IL-6mRNA的表达增强,分别是原来的1.30倍和1.42倍,PTF组与ROS组相比,差异无统计学意义；反映PTF和ROS抑制IL-6 mRNA的作用因PDTC的加入而受到影响。
4.PTF对骨骼肌细胞培养上清中IL-6蛋白含量的影响模型组细胞培养上清中IL-6蛋白含量明显增加,为(612.58±18.60)pg/ml,与正常组相比,统计学差异显著；加入PDTC后,模型组IL-6蛋白含量为(299.48±11.16)pg/ml(p<0.01)；加入PTF、ROS后,IL-6蛋白含量明显下降,分别为(239.31±10.69)pg/ml和(251.27±11.44)pg/ml,与模型组相比,统计学差异显著；PTF、ROS组在加入PDTC后IL-6蛋白含量升高,分别为(323.08±9.69)pg/ml和(351.81±10.47)pg/ml,差异有统计学意义。PTF与ROS组相比,差异无统计学意义；同样反映PTF和ROS抑制IL-6蛋白的作用因PDTC的加入而受到影响。
结论:
1、棕榈酸(Palmitate)诱导培养16 h明显抑制C2C12骨骼肌细胞葡萄糖的摄取,此方法可成功建立骨骼肌细胞胰岛素抵抗模型,适用于对胰岛素抵抗具有潜在作用的中西药物的筛选及其机制研究。
2、PTF在不产生细胞毒作用的前提下,可明显促进胰岛素抵抗模型骨骼肌细胞葡萄糖消耗和摄取,揭示其能增加骨骼肌细胞对胰岛素的敏感性、改善胰岛素抵抗。
3、Palmitate可上调IL-6 mRNA及蛋白表达,PTF可以抑制Palmitate培养下骨骼肌细胞IL-6 mRNA及蛋白表达,这一作用可因加入核转录因子κB(NF-κB)阻滞剂--pyrrolidine dithiocarbamate(PDTC)而受到抑制,反映其作用途径可能与NF-κB有关。
4、PTF影响C2C12骨骼肌细胞葡萄糖摄取以及细胞因子IL-6表达的效应可能是其增加胰岛素的敏感性、改善IR的细胞分子作用机制之一。这将为以胰岛素抵抗和慢性炎症为基本病理生理学的相关疾病的防治提供新的思路,拓宽了应用中医或中西医结合的方法防治胰岛素抵抗的途径。然而PTF改善胰岛素抵抗的具体机制以及PTF新的治疗靶点仍值得进一步研究及探讨。