肉毒梭菌中毒是由肉毒梭菌毒素引起的一种致命性麻痹性疾病,严重危害人类和动物健康。肉毒中毒是一种威胁公众安全的传染病,其特点是发病快,致死率高。肉毒梭菌毒素是厌氧性肉毒梭菌(C.botulinum)生长在厌氧条件下产生的一种蛋白质神经外毒素。它对人类和动物都是致命的,是目前已知最强的外毒素。近年来,食源性肉毒中毒事件不断增加,罐头食品、发酵饲料、真空包装食品等可以产生厌氧条件,这些都会导致肉毒梭菌的生长,并会污染食物。国外很早具有动物肉毒事件的报道,截至目前,全球已有20多个国家和地区发布的文件中均报告了肉毒中毒案件,而我国也有超过十六个省份报道动物肉毒事件的发生。根据肉毒梭菌的各种抗原血清型不同,一般认为肉毒梭菌分为七种,从A到G型,最新有H型被发现。中国的流行性肉毒梭菌主要是A型和B型。肉毒梭菌中毒的病情非常危险,且临床症状是不具有典型性,不易被确诊,往往会因为缺乏对肉毒中毒的认识导致错诊,延误了最佳治疗时机,这种情况频繁发生。因此,在发病前期准确地识别肉毒中毒更为重要。检测肉毒中毒的传统方法是先通过试验室菌群培养临床样品,然后再使用生物学检测方法进行检测。然而,这种检测方法不但操作复杂,检测周期也很长,一般在10天以上,不利于肉毒中毒的临床诊断和及时控制肉毒中毒的风险。因此,建立一种快速、高效、准确的肉毒梭菌检测方法是一个亟待解决的问题。试验目的:本研究以临床样本粪便做为检测基质,初次尝试建立微滴式数字PCR检测法应用于A型和B型肉毒梭菌的检测,评价该方法在肉毒梭菌感染诊断中的优缺点以及对实际临床样本检验能力的探究。试验方法:利用临床测试方法分离并鉴定到的临床样品中的肉毒梭菌菌株,比较肉毒梭菌A型和B型毒素基因的保守序列,并设计肉毒梭菌基因序列的特异性引物和探针对。利用设计的引物和肉毒梭菌临床分离株构建针对A型和B型肉毒梭菌毒素基因质粒标准品,用于对液滴数字PCR方法的构建,并不断优化dd PCR反应条件。使用质粒标准品,线性分析液滴数字PCR方法的灵敏度,引物探针的特异性和试验检测方法的可重复性,并比较荧光定量PCR方法的结果,以分析这种数字PCR检测方法的优缺点。同时使用新建微滴式数字PCR检测法检测含有A型及B型肉毒梭菌孢子的模拟土壤临床标本进行验证,对比荧光定量PCR方法检测结果,评估本试验所建立方法临床检测的能力。最后,使用已知阳性临床样本进行验证构建数字PCR法的临床样本的实用性。试验结果:结果显示,本次试验采用常规试验室手段,包括动物试验、增菌培养和检出试验、分离与纯化试验、革兰染色镜检、16SRNA检测等手段,从环境样本中分离到肉毒梭菌阳性菌株29株,其中血清型A型2株,血清型B型27株。使用dd PCR方法检测质粒标准品时,A型和B型质粒标准品均出现明显分开的阴阳微滴,所用所有对照菌株扩增体系中均未出现阳性微滴。确定了dd PCR优化的最佳条件,A型肉毒梭菌毒素基因反应体系的退火温度为57.3℃,上、下游引物的最佳浓度为900nm/L,探针的最佳浓度为250nm/L。B型肉毒梭菌的最佳退火温度为57.3°C,最佳引物浓度为800nm/L,探针浓度为350 nm/L。本次建立的dd PCR方法用于A型/B型肉毒梭菌的检测下限很低,针对A型肉毒梭菌定量限为0.42拷贝/u L。针对B型肉毒梭菌的定量限为0.44/u L。试验结果显示A型肉毒梭菌基因组DNA浓度范围在98拷贝/u L～9.8×10~5拷贝/u L范围时,线性关系较好,B型肉毒梭菌基因组DNA浓度范围在29拷贝/u L～2.9×10~5拷贝/u L时,线性关系较好,并且具有很好的重复性,在同批次选取4个梯度浓度的变异系数(CV)﹤8%。本次模拟样本中dd PCR法检测结果和荧光定量PCR检测结果一致,且比荧光定量PCR技术检测更灵敏两个数量级。临床样本检测结果准确率100%,与试验室细菌培养法检测结果一致,证明有很强的临床实用性。试验结论:初步证明构建的dd PCR方法高效、灵敏、特异性好,可用于A型和B型肉毒梭菌快速检测。本方法可作为一种检测肉毒梭菌准确载量的有效工具。此次结果表明本方法可被用于临床肉毒梭菌感染病的诊断,也可用于未来临床疾病监测肉毒梭菌感染病的有效手段。