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不定根发生既是植物器官分化的重要基础理论问题,又关系到无性繁殖和完整植株再生等重大实践问题。在林业生产中,成功地诱导不定根,对实现无性繁殖获得最大遗传增益和产量以及转基因和遗传工程材料的完整植株再生都具有重要的实践意义。本研究以741杨品种试管苗为试材,从解剖学、组织化学、基因组学分别对不定根发生调控机制进行了研究,采用免疫胶体金银染技术对IAA进行初步定位分析;并通过构建与不定根发生相关的cDNA文库,对相关基因进行了筛选。主要的实验结果如下:
1.建立了高效稳定的741杨带叶柄叶片不定根发生体系。通过对741杨不同发育状态、不同取材部位选择,以及诱导生根重要生长调节剂的筛选,确定了以741杨生根试管苗带叶柄叶片为材料,在1/2MS附加0.5mg/LIBA培养基中诱导生根,该体系平均生根率达98.5%,平均生根条数为3条/个,根原基发端时间为3d,诱导稳定率达92.5%;
2.从解剖学角度观察了叶柄不定根发生的过程。结果表明:叶柄内未发现潜伏根源基,诱导生根后不定根原基起源于形成层,属于诱生根原基类型;不定根发生过程为形成层细胞分裂→转变为分生组织细胞群(即形成层加厚)→细胞群发育成根原基→根原基分裂分化形成根,当根系穿过皮层,突破表皮时,诱导时间为7d;
3.从免疫组织化学的角度初步探索了不定根发生过程IAA的分布情况。结果显示:在不定根诱导初期(0~2d),叶柄中IAA分布较少,一般分布在细胞外周;在不定根原基形成阶段(3~5d),IAA大量积累在根原基细胞群的细胞外周;在不定根伸长阶段(6~7d),IAA集中分布根尖;
4.从与不定根发生相关的主要酶活性变化,研究了不定根发生过程中IAA氧化酶、过氧化物酶、多酚氧化酶的活性与不定根发生的关系。结果显示:IAA氧化酶在不定根诱导初期(0~2d)活力下降,随后上升,到第5d时酶活力达到最大值,然后又开始减弱;而过氧化物酶、多酚氧化酶呈上升的趋势;
5.成功地构建了741杨带叶柄的叶片不定根发生过程的cDNA文库。经检测该库容量为1.285×106,重组率为97.2%,PCR结果表明插入片段平均长度为600~700bp,可见此文库的代表性较好,满足EST构建和基因分离等工作的需要;
6.通过对部分克隆测序及129个有效序列的生物信息学分析,筛选出一个与不定根发生相关的基因——S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因(SAMS)。通过将测序结果与NCBI数据库的已有的EST数据比对及初步分类,结果显示:22个基因编码产物为与蛋白质合成密切相关的核糖体蛋白,与胁迫相关基因15个,光合作用相关基因有6个,蛋白降解相关基因7个,此外还有2个基因分别与信号转导及植物激素运输代谢相关,此外还有38%的基因是未知的;
综上所述,741杨不定根发生体系的建立和优化,为不定根发生的基础生物研究提供了坚实基础;此外不定根发生的解剖学研究、免疫组织化学研究、酶活性研究以及cDNA文库的构建和EST分析又是不定根发生调控机制的新进展。