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研究背景：免疫性血小板减少性紫癜(Immune Thrombocytopenic purpura, ITP)是一种获得性器官特异性自身免疫性疾病。患者体内产生抗血小板自身抗体,导致网状内皮系统破坏吞噬血小板,从而引起血小板减少。依据ITP发病持续时间,可以分为新诊断的,持续性和慢性ITP。自上世纪50年代以来,研究人员对ITP的发病机制进行了大量的研究。特别是近年来随着免疫学的发展,人们对其发病机理的认识有了很大的提高,经典机制认为ITP的发病是由自身抗体介导的,但细胞免疫在ITP发病中亦起着重要作用。对于ITP患者T细胞的异常已有报道,包括血小板特异的自身反应性T细胞的活化.增强的针对血小板的细胞毒作用,调节性T细胞的缺失等。本文探讨ITP患者中T辅助细胞CD4+(helper T cell, Th)细胞免疫状态以及其与治疗反应的关系,检测ITP患者CD4+细胞中Thl/Th2/Thl7/Treg细胞亚群的比例及其分泌的细胞因子情况,并研究它们随疾病不同状态的变化,进一步清楚了解T细胞在ITP发病中的作用,为ITP患者的治疗提供新的理论依据。蛋白芯片是一种高通量监测系统,通过靶分子和捕捉分子相互作用来监测蛋白分子之间的相互作用。蛋白芯片能够同时检测多种细胞因子,有助于阐明细胞因子在ITP发病中的作用,为靶向治疗提供理论依据。目的：检测ITP患者糖皮质激素治疗前后体内CD4+细胞比例以及CD4+细胞Thl/Th2/Th17/Treg细胞亚群相关细胞因子及其转录因子的表达,研究ITP患者CD4+细胞亚群分布特点及与临床的关系。检测ITP患者外周血中40种与CD4+细胞相关的细胞因子的变化,旨在利用蛋白芯片技术观察这40种细胞因子在疾病的不同时期的表达,了解与ITP疾病状态相关的细胞因子。方法：应用流式细胞计数方法检测ITP患者外周血CD4+细胞百分率、CD8+细胞百分率、CD4+/CD8+细胞比值,并分析它们与ITP患者外周血血小板的相关性。应用流式细胞计数方法检测实时荧光定量RT-PCR方法检测了20例初发ITP患者(男性8例,女性12例,中位年龄41.0yrs)外周血单个核细胞CD4+细胞Th1/Th2/Th17/Treg细胞亚群相关细胞因子及转录因子T-bet, IFN-γ, GATA-3, TGF-β, Foxp3, IL-2, IL-4等的表达,并检测了患者接受糖皮质激素治疗后以及20例正常对照者外周血单个核细胞中T-bet, IFN-y, GATA-3, TGF-P, Foxp3, IL-2, IL-4基因表达水平。同时应用RayBio(?) Human Inflammation Antibody Array3细胞因子抗体芯片盒检测ITP患者的外周血中40种细胞因子变化。蛋白芯片技术检测了30例初发患者、30例完全缓解患者的血浆中Thl/Th2/Th47/Treg细胞相关的40种细胞因子蛋白的表达情况,并分析这些细胞因子与患者病情的相关性。结果：实时荧光检测中所有ITP患者均能完成糖皮质激素治疗,未发生明显治疗不良反应,治疗前血小板计数为(17.6±13.8)×109/L,治疗后血小板计数达到(123.8±52.8)×109/L,其中12例取得完全缓解(血小板计数≥100×109/L),7例取得部分缓解(血小板计数≥>50×109/L),1例治疗后血小板计数仅达到45×109/L,但出血症状明显改善。治疗前患者外周血单个核细胞中T-bet, IFN-γ、IL-2表达均较正常对照明显升高,差异有显著统计学意义(p<0.01)；治疗后Foxp3表达较治疗前升高(p<0.05), T-bet、IFN-γ、IL-2、IL-4表达均较治疗前降低(p<0.05),其中IL-2表达仍较正常对照升高(p<0.01)。Thl细胞相关基因(T-bet, IFN-γ、IL-2)中,T-bet、IFN-γ在各亚组中治疗后表达水平均较治疗前降低(p<0.05),IL-2在各亚组中治疗后表达水平亦较治疗前降低,但在治疗前血小板计数<10×109/L及治疗后血小板计数<100x109/L患者中治疗前后差异无统计学意义。Th2细胞相关基因(GATA-3、IL-4)在各亚组中治疗前后差异均无统计学意义。Treg细胞相关基因(Foxp3、TGF-β)中,Foxp3在治疗前血小板计数<10x109/L患者中治疗后表达水平较治疗前明显升高(p<0.05); TGF-β在老年患者与年轻患者中呈现截然相反的变化模式,其在年龄<60yrs患者中治疗后表达水平较治疗前降低(p<0.05),而在年龄≥60yrs患者中治疗后表达水平较治疗前升高(p>0.05)。细胞因子蛋白芯片实验发现,与正常健康人相比,初发ITP患者升高2倍以上的细胞因子有：EOTAXIN, EOTAXIN-2, GM-CSF, G-CSF, IFN-γ, IL-1β, IL-2, IL-4, IL-6, IL-7, IL-11, IL-12p40, IP-10, MCP-1, M-CSF, RANTES, PDGF-B;而细胞因子I-309, IL-la, IL-3, IL-6sR, IL-8, IL-10, IL-12p70, IL-13, IL-15, IL-16, MIG, MIP-1α, MIP-1β, MIP-1δ, TGF-β1, TNF-α, TNF-β, sTNFRI, TIMP-2与正常对照组相比变化在2倍以内；降低2倍以上的细胞因子有ICAM-1, IL-17, sTNFRII MCP-2。ITP患者缓解时,EOTAXIN, EOTAXIN-2, IFN-γ, IL-1β, IL-2, IL-6, IL-11, IL-12p40, IL-7, IP-10, MCP-1这些在患者初发时升高2倍以上的因子恢复到正常水平,与正常组相比变化在2倍以内。缓解时仍然升高2倍以上的细胞因子有：RANTES, G-CSF, PDGF-B, GM-CSF, M-CSF, IL-4,而ICAM-1, IL-8在初发时未见升高而缓解时升高2倍。结论：ITP患者存在Th细胞功能异常,Thl/Th2/Thl7/Treg细胞亚群的比例失衡。糖皮质激素治疗仍是针对初治ITP患者的有效治疗手段,其作用机制可能与抑制Thl、Th2细胞亚群(以Thl细胞亚群为主)以及诱导Treg细胞亚群有关。Th细胞免疫状态监测可能成为ITP患者疗效评估与预后评价提供思路。蛋白芯片能以极小的样本量检测高通量的细胞因子,是筛选ITP相关的细胞因子的比较理想的技术方法。