研究背景骨关节炎(osteoarthritis,OA)是一种累及肌肉骨骼系统,以关节软骨受损,发生病理性退变和继发性骨质增生为主要特征的退行性疾病。骨关节炎的发生源于力学和生物学因素共同作用下导致软骨细胞、细胞外软骨基质和软骨下骨质三者降解和合成平衡破坏。骨关节炎可累及全身各个关节,但以膝关节、手关节、髋关节居多。骨关节炎患者随病程进展可出现关节疼痛和功能受限,影响生活质量,严重者无法工作甚至导致残疾。根据发达国家统计显示,骨关节炎是除心血管疾病外,导致50岁以上男性人群失去工作能力的第二风险因素。失业会进一步加重患者的经济负担,导致更为严重的社会经济问题。据流行病学家统计,2017年全球有超过3亿人受到了关节炎的侵扰。我国40岁以上人群的患病率约为10-17%。关节软骨为透明软骨,主要由软骨细胞和细胞外软骨基质构成。软骨基质为关节软骨的主要组成部分,是维持软骨细胞外环境稳定、负责软骨生理功能和力学特性的物质构成基础。基质蛋白是软骨基质中的重要组分,可以与胶原结合,协助构建软骨中纤维支架网络,维持软骨的强度和稳定。此外,基质蛋白还可以作为配体与软骨细胞表面的受体结合,调节软骨细胞迁移、增殖、分化等一系列生理功能。目前研究发现在骨关节炎发生后,软骨基质蛋白可以通过调节软骨和滑膜中的信号通路从而影响炎症进程。SPARC(secreted protein acidic and rich in cysteine)家族蛋白最早是从骨骼中分离得到,又被称作骨粘连蛋白或BM-40蛋白,是目前研究最多的细胞外基质蛋白,在骨骼矿化、细胞与基质的相互作用和骨重塑等方面扮演了重要角色。SPARC家族成员之一的分泌性模块化钙结合蛋白—SMOC(SPARC related modular calcium-binding protein)包括 SMOC1 和 SMOC2 两个亚型。SMOC2 基因位于染色体6q27,在组织中广谱表达,并与骨骼发育息息相关。在胚胎期小鼠肢体中即可检测到Smoc2基因表达,并且在骨骺生长板中表达较高。SMOC2基因敲除的动物模型可出现颅面部骨骼发育异常。SMOC2基因突变的患者表现出小牙和少牙畸形。在骨祖细胞中,SMOC2的高表达可以抑制细胞的成骨分化和细胞外基质的矿化过程。本课题组在前期发现SMOC2基因突变还可导致患者出现常染色体显性遗传的多发性骨骺发育不良(multiple epiphyseal dysplasia,MED),该遗传性骨病的标志性临床表现之一就是早发性骨关节炎。基于以上线索,我们推测在骨骼系统疾病,特别是骨关节炎的进展中,SMOC2可能发挥一定作用。软骨基质进行性降解是骨关节炎的标志性病理特征。胶原和蛋白多糖是基质的主要组成部分,可以被基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase,MMP)和去整合素金属蛋白酶(a disintegrin and metalloproteinase with thrombospondin motifs,ADAMTS)降解。在骨关节炎进展中,软骨细胞合成基质分子的能力受到抑制,MMP和ADAMTS表达增高,基质合成-降解平衡遭到破坏。炎性细胞因子白介素(interleukin,IL)和肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor,TNF)在骨关节炎的发生发展中也扮演了重要角色。它们能抑制基质分子的表达,同时刺激蛋白酶的分泌,诱导软骨细胞凋亡,并刺激其他炎症因子的合成,从而加剧软骨的破坏。有研究报道,软骨细胞在受到某些基质蛋白刺激后,胶原和蛋白聚糖的表达降低,炎症因子和蛋白酶表达升高,从而加速了骨关节炎的进展。NF-κB通路参与了包括骨关节炎、类风湿性关节炎、哮喘、动脉粥样硬化等多种炎症和风湿性疾病的病理进程。在骨关节炎进展中,NF-κB不仅可以介导炎症因子、趋化因子、受体分子和蛋白酶等一系列促炎分子的表达,还可以调控软骨细胞增殖、凋亡的细胞周期进程,是骨关节炎药物治疗的重要靶点。有研究表明Smoc2基因敲除小鼠可以拮抗肺纤维化和肝脏脂肪变性进程中Nf-Kb激活的炎症反应,提示SMOC2可能通过激活NF-κB通路而调控炎症反应。SMOC2作为存在于关节软骨中的细胞基质蛋白,在骨骼发育和炎症反应中都发挥了重要作用,我们推测SMOC2可能参与了骨关节炎的发生发展进程。为此我们提出了以下问题:第一,SMOC2在骨关节炎患者中表达如何;第二,SMOC2在骨关节炎的病程中,是否参与了炎症进程及具体影响的分子机制。在本研究中,我们将对以上问题进行探索。研究目的1、检测SMOC2在骨关节炎软骨和正常软骨中的表达量,并探究软骨退变程度和SMOC2表达水平的关联性。2、检测SMOC2在不同人群体液中含量的差异,并探究血清中SMOC2的含量与软骨退变标志物及骨关节炎临床指标的相关性。3、探究SMOC2对软骨细胞炎症反应的影响以及在小鼠骨关节炎进程中所发挥的作用。研究方法及材料1、收集骨关节炎患者和正常人膝关节胫骨平台处软骨,提取总RNA进行实时定量PCR实验,对比骨关节炎软骨和正常软骨中SMOC2的mRNA表达量。同时对骨关节炎软骨组织包埋切片,进行HE及番红固绿染色,根据OARSI(Osteoarthritis Research Society International)评分对软骨退变进行分级。利用免疫组织化学染色观察不同分级软骨组织中SMOC2蛋白的表达,利用Image J分析组织SMOC2染色阳性程度。并分析SMOC2染色阳性程度和软骨退变OARSI分级是否具有相关性。2、收集骨关节炎患者和非退变性膝关节损伤(半月板、韧带损伤)患者的关节液,利用Elisa试剂盒检测,对比两者中SMOC2蛋白含量是否有差异。收集骨关节炎患者、非退变性膝关节损伤患者和正常体健人群的血清样本,检测不同人群血清中SMOC2蛋白含量。同时检测骨关节炎患者血清中软骨退变标志物和炎症因子的含量,并收集骨关节炎患者临床资料,将血清中SMOC2含量同临床症状评分和实验室指标做相关性分析。3、利用重组SMOC2蛋白(rhSMOC2)刺激原代小鼠软骨细胞,提取总RNA和蛋白质,采用实时定量PCR和Western blot检测软骨细胞受到SMOC2刺激后合成基质分子、炎症因子和金属蛋白酶的能力。同时通过Western blot实验检测rhSMOC2刺激后,人软骨细胞C28/I2和原代小鼠软骨细胞中NK-κB通路蛋白激活情况,并利用细胞免疫荧光染色观察P65入核情况。4、对野生型C57BL/6小鼠进行膝关节半月板不稳定手术(Distablization of Medial Meniscus,DMM)造模,诱导小鼠骨关节炎发生,取小鼠膝关节包埋切片后,采用HE和番红固绿染色检测软骨退变,免疫组化检测Smoc2表达。同时向DMM造模后小鼠的关节腔内注射rhSMOC2后对膝关节切片进行HE和番红固绿染色,观察软骨的破坏情况,并利用免疫组化检测肥大软骨细胞标志物的表达情况。研究结果第一部分SMOC2在骨关节炎患者关节软骨及体液中的表达我们收集了 28例因骨关节炎行关节置换术的患者的胫骨平台软骨,作为骨关节炎软骨,3例因车祸而行股骨髁上截肢患者的胫骨平台处软骨,作为正常软骨对照。首先提取5例骨关节炎软骨及3例正常软骨的总RNA,检测SMOC2的表达情况。结果显示,SMOC2在骨关节炎软骨中的mRNA表达高于正常软骨。之后从31例软骨标本中分离得到共41例软骨骨块,脱钙包埋切片,染色后根据OARSI分级,将软骨退变程度分为GO到G4。ImageJ计算SMOC2在软骨中表达的相对阳性程度。Spearman等级相关分析结果显示,随软骨退变程度增加,SMOC2蛋白表达升高,两者呈正相关趋势(r=0.816,p<0.001)。提示SMOC2可能在骨关节炎疾病进展中发挥一定作用。我们收集了 10例因骨关节炎行关节置换术的患者的关节液及5例因半月板或韧带损伤行关节镜手术患者的关节液进行检测。结果显示,骨关节炎患者的关节液中SMOC2含量明显高于关节镜手术患者,提示SMOC2在关节液中的含量可能随软骨受损情况加重而升高。进一步研究其在血液中表达情况。收集到38例骨关节炎患者血清(OA组),11例半月板或韧带损伤患者血清(Non-OA组),10例健康人群血清(Normal组)。Elisa结果显示,OA组与Non-OA组患者血清中SMOC2含量无明显差异,但两组数值均明显高于Normal组。同时收集OA组患者的其他临床及实验室指标,Spearman等级相关分析结果显示,OA组患者血清中SMOC2含量与软骨降解标志物COMP(r=0.328,p=0.045)、WOMAC骨关节炎指数(r=0.328,p=0.044)和VAS疼痛评分(r=0.366,p=0.024)正相关。多元逐步回归分析显示血清COMP含量(p=0.003)和VAS评分(p=0.004)是血清SMOC2含量升高的相关因素。这一部分结果显示血清中SMOC2含量可能与患者的临床症状存在相关性,SMOC2可能是反应骨关节炎严重程度的潜在标志物。第二部分 SMOC2促进软骨细胞炎症发生和分解代谢从新生小鼠肋软骨中分离得到原代软骨细胞进行培养,以Oμg/m1、0.1μg/ml、1μg/ml、5μg/ml、25μg/ml、50μg/ml 浓度递增的 rhSMOC2 刺激 24h 后提取总 RNA和蛋白质,结果显示Ⅱ型胶原(Col2a1)和蛋白聚糖(Acan)的表达随rhSMOC2浓度增高而逐渐降低,软骨细胞合成基质分子的能力受到抑制。同时软骨细胞的炎症反应增强,炎症因子IL-1β、IL-6、iNos、Cox2、趋化因子Cc15和可以直接降解软骨基质中成分的蛋白酶Mmp3、Mmp13、Adamts4表达升高,且增高的程度呈现出对rhSMOC2刺激的浓度依赖性。IL-1β的抑制剂,IL-1ra表达受到SMOC2的抑制。SMOC2可以促进软骨降解和炎症反应。为研究SMOC2与炎症通路NF-κB通路的关系,以0μg/ml、0.1μg/ml、1μg/ml、25μg/ml浓度递增的rhSMOC2刺激人C28/I2软骨细胞系15min,30min和60min。结果显示P65磷酸化水平增高,NF-κB通路被激活。同样的激活效应在原代小鼠软骨细胞中也得到证实。进一步利用细胞免疫荧光染色发现,以浓度为1μg/ml的rhSMOC2刺激6h后,C28/I2和原代小鼠软骨细胞中P65核转位增强。SMOC2可能通过激活NF-κB通路促进骨关节炎的炎症反应。第三部分SMOC2促进小鼠骨关节炎的进程对8周龄野生型C56BL/6雄性小鼠进行DMM手术诱导骨关节炎的发生,以施假手术SHAM组作为对照,每组各5只小鼠。术后8周时处死小鼠,取小鼠膝关节包埋切片,组织学分析显示DMM组小鼠膝关节出现明显骨关节炎表现,提示造模成功。且DMM组小鼠软骨和滑膜中Smoc2的表达高于SHAM组。随后为进一步在体内验证SMOC2的促炎作用,对DMM手术诱导后的小鼠进行关节腔内注射rhSMOC2,并设置术后注射PBS的小鼠为对照组,每组各5只小鼠。术后每周注射1次,4周后处死小鼠。组织学分析显示rhSMOC2注射组的小鼠,软骨破坏增强,且肥大软骨细胞标志物X型胶原(Col10a1)和Runx2表达增强。SMOC2可以促进DMM诱导的小鼠骨关节炎进程。研究结论1、SMOC2作为软骨基质蛋白的一员,在骨关节炎软骨中表达升高,且表达水平和软骨退变程度正相关,提示SMOC2可能促进骨关节炎进展。2、SMOC2在骨关节炎患者的关节液和血清中含量升高。SMOC2在血清中的含量和软骨损伤标志物COMP、WOMAC骨关节炎指数和VAS疼痛评分正相关,血清中SMOC2含量可能在骨关节的诊断和反应疾病进展程度方面具有临床意义。3、体外和体内实验的结果表明,SMOC2可以加剧软骨基质的降解和软骨细胞的炎症反应,具体机制可能与激活NF-κB介导的炎症通路有关。SMOC2为促进骨关节炎疾病进展的促炎分子。