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第一部分膀胱肿瘤特异性溶瘤腺病毒治疗膀胱癌目的膀胱癌是泌尿系统常见肿瘤,目前对膀胱癌的治疗主要有手术、放疗、化疗等多种方法,但疗效尚不能使人满意。探讨新的疗法十分必要。肿瘤的发生发展与基因的改变密切相关,基因治疗就是试图通过针对基因物质的作用达到治疗肿瘤的目的。近年来肿瘤的基因治疗发展迅速。uroplakin是尿路上皮特异性糖蛋白,前列腺干细胞抗原(prostate stem cell antigen,PSCA)在膀胱癌高表达而在正常组织低表达。本研究的目的就是通过前列腺干细胞抗原增强子(prostate stem cell antigen,enhancer,PSCAE)和尿路特异糖蛋白Ⅱ(uroplakinⅡ,UPⅡ)启动子构建膀胱特异性溶瘤腺病毒载体以寻求膀胱癌靶向治疗的新方案。方法通过Western-blot检测UMUC-3,5637,HepG2,PC3,LNCAP,BGC823和NHU细胞PSCA和AR的表达。通过PCR技术获得前列腺干细胞抗原增强子PSCAE和uroplakinⅡ的启动子(UPⅡpromoter)。通过酶切从质粒pBK-CMV-Luc获得荧光素酶报告基因Luc,从质粒RpS-TOAD-PSE-PBN—E1A酶切获得E1A基因,并将PSCAE,UPⅡ,Luc,E1A和无编码对照序列Null定向连接入穿梭质粒,构建出质粒RpS-UPⅡ-E1A;RpS-E-UPⅡ-E1A;RpS-UPⅡ-Luc;RpS-E-UPⅡ-Luc;RpS-UPⅡ-Null;RpS-E-UPⅡ-Null。利用同源重组原理获得腺病毒质粒Ad-E-UPⅡ-E1A、Ad-UPⅡ-E1A、Ad-RpS-E—UPⅡ-Null;Ad-RpS-UPⅡ-Null。并且通过脂质体转染的方法用质粒Rp-UPⅡ-Luc和Rp-E-UPⅡ-Luc转染膀胱癌细胞T24,UMUC-3,5637,和非膀胱癌细胞HepG2,PC3,BGC823以及尿路上皮细胞NHU。pCMV-β-gal作为内参照。转染后在含有雄激素或雄激素受体拮抗剂的培养液中培养,24小时后裂解细胞并检测细胞裂解液内萤光素酶活性和半乳糖苷酶活性,以荧光强度与半乳糖苷酶反应后吸光度的比值作为校正的萤光素酶活性。将腺病毒质粒线性化后转染293细胞,包装成腺病毒颗粒。鉴定后分别感染膀胱癌细胞进行溶细胞活性观察。结果:①本研究构建的质粒均通过PCR和酶切双重鉴定来确定产物正确。②通过Western-blot检测T24,UMUC-3,5637,HepG2,PC3,LNCAP,BGC823和NHU细胞中PSCA和雄激素受体AR的表达,膀胱癌细胞T24,UMUC-3,5637和前列腺癌细胞PC3,LNCAP以及胃癌细胞系BGC823都高表达PSCA。NHU和肝癌细胞HepG2呈现PSCA低表达。膀胱癌T24,和5637细胞AR+,而膀胱癌UMUC-3细胞AR-。前列腺癌细胞LNCAP为AR+,而前列腺癌细胞PC3为AR-,NHU细胞AR-。③经Rp-UPⅡ-Luc质粒转染膀胱癌细胞和尿路上皮细胞都可以导致较高的萤光素酶活性表达,但在非泌尿系来源性细胞中表达较低,差异有显著性。经Rp-E-UPⅡ-LUC质粒转染后也可以导致膀胱上皮癌细胞中萤光素酶活性明显高于非泌尿系统来源细胞的表达,差异有显著性(P＜0.01)。Rp-E-UPⅡ-LUC转染后膀胱癌细胞中萤光素酶活性明显高于正常尿路上皮表达,差异有显著性(P＜0.01)。PSCAE置于UPⅡ上游可以提高膀胱癌细胞中萤光素酶活性而在正常尿路上皮细胞和其他组织来源肿瘤细胞中却不增加其活性表达。④雄激素受体激动剂R1881可以提高Rp-E-UPⅡ-LUC转染后的AR阳性膀胱癌细胞T24和5637中萤光素酶活性,而对AR阴性膀胱癌细胞UMUC-3中不能明显提高其萤光素酶活性。雄激素受体阻断剂Flutamide不能使Rp-E-UPⅡ-LUC在AR阴性和阳性细胞活性下调。R1881和Flutamide对Rp-UPⅡ-LUC在膀胱癌中萤光素酶活性影响不明显。R1881和Flutamide对Rp-UPⅡ-LUC和Rp-E-UPⅡ-LUC在非膀胱癌细胞中活性的影响不明显。⑤将腺病毒包装后获得的腺病毒Ad-Rp-E-UPⅡ-E1A转染膀胱癌细胞T24后能够导致明显的细胞病变并最终裂解肿瘤细胞。结论:uroplakinⅡ启动子能够驱动目的基因在膀胱癌中高表达,而在其他组织来源肿瘤细胞中低表达,具有组织特异性。PSCAE能够增强uroplakinⅡ启动子在膀胱癌细胞中的活性而在非尿路上皮来源细胞和正常尿路上皮细胞中增强作用不明显。雄激素受体激动剂可以在AR阳性膀胱癌细胞中提高PSCAE活性而在AR阴性膀胱癌细胞中和正常尿路上皮以及其他组织来源肿瘤中却不能。雄激素受体阻断剂不能完全阻断PSCAE活性,说明PSCAE具有部分雄激素非依赖特性。基于PSCAE和UPⅡ启动子的溶瘤腺病毒Ad-Rp-E-UPⅡ-E1A可以有效裂解膀胱癌细胞。第二部分丁酸钠作用2小时可以提高膀胱癌对化疗药物的敏感性目的观察HDAC抑制剂丁酸钠(sodium butyrate,NaB)对膀胱癌细胞生长的抑制作用以及丁酸钠与抗癌药物联用对膀胱癌的杀伤作用的体内外研究。方法通过MTT法检测丁酸钠单用或分别与ADM、MMC和DDP联用对膀胱癌细胞生长的抑制作用。Hochest33258染色和电镜观察丁酸钠处理后细胞形态学变化。流式细胞术检测bcl-2,BAX,caspase-3表达。观察膀胱灌注丁酸钠联合腹腔注射化疗药物对N-甲基亚硝基脲(MNU)诱导的膀胱癌模型大鼠肿瘤生长的抑制作用。通过Western blot检测丁酸钠处理后乙酰化组蛋白3,bcl-2表达的变化。结果丁酸钠对EJ,BIU87,5637细胞的抑制率均随着浓度的增加而明显增加。电镜观察和Hochest33258染色显示丁酸钠可以诱导膀胱癌细胞凋亡。丁酸钠可下调膀胱癌细胞bcl-2的表达上调caspase-3的表达。5mM丁酸钠与ADM、MMC、DDP联用具有明显的协同作用;5mM丁酸钠处理细胞2小时后可提高膀胱癌对化疗药物的敏感性。经丁酸钠膀胱灌注可以明显抑制膀胱癌模型大鼠肿瘤生长,肌侵润癌比例明显低于未治疗组。结论丁酸钠可明显抑制膀胱肿瘤的生长并与化疗药物有协同作用,2小时丁酸钠处理膀胱癌细胞能增强抗癌药物对膀胱癌细胞的杀伤作用。丁酸钠有望成为膀胱癌灌注治疗的理想药物。