研究背景及目的NK/T 细胞淋巴瘤(natural killer/T-cell lymphoma,NKTCL)是一种源于成熟NK细胞或细胞毒T细胞的高度侵袭性非霍奇金淋巴瘤,具有预后差、生存期短等临床特点。该疾病成年男性发病率高于女性,在亚洲和中南美洲多见,与EB病毒(Epstein-Barr virus,EBV)的感染有很强的关系。NKTCL经常发生在鼻腔、鼻窦、鼻咽等上呼吸道,偶尔也会发生在皮肤、消化道、睾丸等。目前对于NKTCL尚无标准的一线治疗方案,初期常使用蒽环类药物为基础的治疗方案,但由于肿瘤细胞高表达P-糖蛋白而易产生耐药。现常用的治疗手段为以左旋门冬酰胺酶或培门冬酶为基础的化疗或联合放疗方案,但是由于该疾病高度的侵袭性以及易产生多药耐药(multiple drug resistance,MDR),其完全缓解(complete remission,CR)率仅为 50-60%,5 年总生存(overall survival,OS)率在50%左右。因此,了解该病的发病机制,探索更为安全有效的靶向治疗方案,对提高治愈率、延长患者的生存期尤为重要。NKTCL的发病机制不明,近年来随着高通量分子和基因组学研究技术的应用,陆续发现了一些与该疾病发生发展相关的分子生物学改变。利用基因表达谱分析发现了一系列与NKTCL有关的异常信号通路,如Janus激酶(Janus kinase,JAK)/信号转导和转录活化因子(signal transducer and activator of transcription,STAT)、丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)、蛋白激酶 B(protein kinase B,Akt)、核转录因子-κB(nuclear factor κB,NF-κB)等;利用高通量测序技术发现了一系列NKTCL的高频突变基因,如JAK3、STAT3、GNAQ、DDX3X 和 TP53 等。此外,染色体 6q21-25 的缺失、EBV的感染以及免疫微环境的异常也可能共同参与了 NKTCL的发生发展。基因的转录后调控是其能否正常表达蛋白并且行使其功能的重要因素,RNA结合蛋白(RNA binding proteins,RBPs)则是主要参与者之一,其表达可受多种转录因子的调控。RBPs在多种肿瘤中存在失调,可影响肿瘤发生发展的每一步,如促进细胞增殖和生存、免疫监视逃逸、远处转移和血管的形成。多聚腺苷酸结合蛋白[poly(A)-binding proteins,PABPs]是一类普遍存在于真核生物中的RBPs,能够特异性识别并结合多聚核苷酸序列,与真核起始因子(eukaryotic initiation factors,eIFs)、PABP 结合蛋白 1(PABP-interacting protein 1,PAIP1)共同组成翻译起始复合物的重要组成部分。常见的PABPs包括PABPC1、PABPC3和PABPC4,其中PABPC1参与mRNA代谢的许多通路,包括多聚腺苷酸化/脱腺苷酸化、翻译的起始和维持mRNA的稳定等,并且可与其他基因或miRNA相互作用调控肿瘤细胞增殖、凋亡、耐药等。本课题组前期对NKTCL细胞株转录组测序发现,PABPC1在NKTCL细胞株中较正常NK细胞表达升高。细胞内的转录和翻译经常是RNA和DNA病毒作用的靶点,PABPs则可被募集并帮助病毒的翻译,如EBV病毒、人乳头瘤病毒等,而NKTCL的发生发展与EBV的感染有着密切的关系。不仅如此,在EBV反复活化的鼻咽癌肿瘤组织中,PABPC1的表达亦明显升高。为此,我们开展了PABPC1在NKTCL中的表达情况、调控机制、生物学功能以及作用机制的研究:首先我们通过RT-qPCR和Western blot检测PABPs在正常NK细胞和NKTCL细胞株中的表达,初步了解并验证常见的PABPs在正常细胞和肿瘤细胞中的表达差异,并通过免疫组化法检测分析了 PABPC1在NKTCL肿瘤组织中的表达及其与临床预后的相关性;随后通过对PABPC1启动子区转录因子预测,并结合染色质免疫共沉淀(chromatin immunoprecipitation,ChIP)和双荧光素酶报告基因系统的验证,确定在NKTCL中调控PABPC1的转录因子;通过构建过表达和干扰表达PABPC1的稳定传代NKTCL细胞株,研究了该基因在NKTCL细胞株中的生物学功能,并利用转录组测序、Western blot以及抑制剂反向验证该基因可能的下游信号通路;最后通过构建裸鼠移植瘤模型对PABPC1在NKTCL中的作用机制进行进一步的体内功能和机制验证。本研究通过探究PABPC1在NKTCL发生发展中的作用和相关机制,为NKTCL预后标志物的预测和个体化治疗提供了新的思路。第一部分 PABPC1在NK/T细胞淋巴瘤中的表达和临床意义方法1.RT-qPCR 和 Western blot 检测 PABP 家族中 PABPC1、PABPC3 和 PABPC4在正常NK细胞和NKTCL各细胞株(YT、NKYS、NK92、SNK6)中mRNA和蛋白表达水平。2.收集58例初治NKTCL患者肿瘤组织和10例淋巴结反应性增生组织蜡块,应用免疫组化法检测PABPC1在各组织中的表达并评估免疫组化中蛋白表达水平,并采用Mann Whitney U检验对PABPC1在NKTCL肿瘤组织和淋巴结反应性增生组织表达进行差异分析。3.采集患者临床资料,使用Pearson χ2或Fisher精确检验分析PABPC1的表达和临床特点之间的相关性。4.采用Kaplan-Meier进行生存分析,log-rank检验比较PABPC1表达高低与NKTCL患者OS和无进展生存(progression free survival,PFS)的相关性,Cox比例风险回归模型确定影响OS和PFS的预后因素。结果1.与正常 NK细胞相比,PABPC1 在 YT(P=0.011),NKYS(P=0.0.03),NK92(P=0.000)和 SNK6(P=0.005)中 mRNA 表达量均升高;在 PABPC3 和PABPC4中,正常人NK细胞和各细胞株mRNA表达量无统计学差异。Western blot检测的蛋白表达水平与mRNA结果一致。2.在组织中,PABPC1主要在胞浆着色,30(51.7%)例NKTCL为高表达,28(48.3%)例NKTCL为低表达,10例淋巴结反应性增生组织均为低表达。PABPC1在NKTCL肿瘤组织中表达显著高于淋巴结反应性增生组织(P=0.002)。3.PABPC1高表达组和低表达组在患者的年龄、性别、B症状、ECOG评分、LDH、EBV-DNA、淋巴结侵犯、NKTCL 预后评分(NKTCL prognostic index,NKPI)、治疗和治疗反应上均无明显差异,在Ann Arbor分期上有显著差别(P=0.031)。4.PABPC1低表达组患者的中位OS未达到,明显优于高表达组的27个月(HR0.25,P=0.008);PABPC1低表达组的中位PFS未达到,明显高于高表达组的21个月(HR0.36,P=0.009)。COX比例风险回归模型显示,PABPC1高表达(P=0.049)和NKPI中高危(P=0.035)是影响NKTCL患者OS的独立不良预后因素。小结1.PABPC1 在 NKTCL 细胞株(YT、NKYS、NK92、SNK6)较正常 NK 细胞中表达升高,PABPC3和PABPC4在各组中表达无差异。2.PABPC1在NKTCL肿瘤组织较淋巴结反应性增生组织中表达升高。3.PABPC1在NKTCL肿瘤组织中的表达与患者年龄、性别、B症状、ECOG评分、LDH、EB病毒载量、淋巴结侵犯情况、NKPI、治疗和疗效无关,与Ann Arbor分期有关。4.PABPC1高表达是影响NKTCL患者OS的独立不良预后因素。第二部分PABPC1在NK/T细胞淋巴瘤细胞中表达调控、生物学功能及作用机制的探讨方法1.利用JASPAR和TRANSFAC两个数据库的预测,结合前期我们团队对正常NK细胞与NKTCL细胞株转录组差异基因的筛选,预测可能与PABPC1启动子区结合的转录因子。2.RT-qPCR和Western blot检测转录因子在正常NK细胞和NKTCL各细胞株(YT、NKYS、NK92、SNK6)中mRNA和蛋白表达水平;采用慢病毒转染的方法在YT和NK92细胞株中过表达该转录因子,并用流式分选仪筛选GFP阳性细胞株后检测PABPC1 mRNA和蛋白的表达水平变化。3.ChIP-PCR检测转录因子与PABPC1启动子区结合情况,双荧光素酶报告基因系统检测其对PABPC1转录激活情况。4.采用慢病毒转染的方法对PABPC1表达相对较低的YT细胞株进行PABPC1过表达,对表达较高的NK92细胞株进行PABPC1干扰表达,嘌呤霉素筛选成稳定传代细胞株后检测各组PABPC1的mRNA和蛋白表达水平以验证转染效果。5.检测过表达PABPC1的YT细胞株和干扰表达PABPC1的NK92细胞株细胞生物学功能的变化:CCK8法检测PABPC1对细胞增殖的影响;EdU联合7-AAD运用流式细胞术检测PABPC1对细胞增殖周期的影响;Annexin V-APC和7-AAD双染法运用流式细胞术检测PABPC1对细胞凋亡的影响;软琼脂克隆形成实验检测PABPC1对细胞克隆形成能力的影响;Transwell小室检测PABPC1对细胞迁移能力的影响。6.转录组测序比较过表达PABPC1的YT细胞株与空质粒组基因表达差异,应用京都基因与基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)和基因集富集分析(Gene Set Enrichment Analysis,GSEA)对差异基因进行富集分析,推测PABPC1下游可能影响的信号通路并通过Western blot方法进行通路相关蛋白验证。7.对过表达PABPC1的YT细胞株给予通路抑制剂后,进行通路关键蛋白检测和反向功能验证。结果1.PABPC1 启动子区可能存在转录激活子 4(activating transcription factor 4,ATF4)潜在的结合位点,分别为-38bp 至-50bp(Site 1)和-1928bp 至-1940bp(Site 2)。2.与正常 NK 细胞相比,ATF4 在 YT(P=0.026),NKYS(P=0.008),NK92(P=0.000)和SNK6(P=0.000)中mRNA表达均升高,其蛋白表达与mRNA一致。过表达ATF4的YT细胞株和NK92细胞株较对照组ATF4的mRNA水平明显升高(P值分别为0.002,0.001),PABPC1的mRNA水平也明显升高(P值分别为0.001,0.001),同样蛋白表达与mRNA一致。3.YT和NK92中ATF4与PABPC1启动子区的Site 1和Site 2均有结合。ATF4能够显著增强野生型PABPC1启动子的活性(P=0.013),而包含ATF4结合位点突变体1或2的PABPC1启动子,在过表达ATF4的刺激下,其活性与野生型相比明显降低(P值分别为0.005,0.002)。4.慢病毒转染并稳定传代的PABPC1过表达组(YT-Lv-PABPC1)与对照组(YT-Lv-NC)相比PABPC1 mRNA表达显著升高(P=0.000),干扰表达组(NK92-sh-PABPC1)和对照组(NK92-sh-NC)相比 PABPC1 mRNA 表达显著降低(P=0.000),蛋白水平与mRNA一致。5.过表达和干扰表达PABPC1后细胞生物学功能检测:5.1 YT-Lv-PABPC1组与YT-Lv-NC组相比在第3、5、7天细胞增殖显著增加(P值分别为 0.001,0.014,0.006);NK92-sh-PABPC1 组与 NK92-sh-NC 组相比在第3、5、7天细胞增殖显著下降(P值分别为0.017,0.008,0.001)。5.2 YT-Lv-PABPC1组与YT-Lv-NC组相比细胞周期S期明显增多(P=0.016),G0/G1期和G2/M期则无明显变化(P分别为0.086和0.708);NK92-sh-PABPC1组与NK92-sh-NC组相比细胞周期G0/G1期明显升高(P=0.009),S期明显降低(P=0.007),G2/M期无明显变化(P=0.725)。5.3 YT-Lv-PABPC1组与YT-Lv-NC组相比细胞凋亡明显减少(P=0.011),克隆形成能力明显增强(P=0.004),迁移能力明显增强(P=0.000);而NK92-sh-PABPC1组与NK92-sh-NC组相比细胞凋亡明显增多(P=0.017),克隆形成能力则明显减弱(P=0.005),迁移能力明显减弱(P=0.006)。6.转录组测序结果显示,与YT-Lv-NC相比,YT-Lv-PABPC1共有92个基因上调,243个基因下调,随后将差异基因进行KEGG分析和GSEA后得出,PABPC1过表达后可能通过激活磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol-3-kinase,PI3K)/Akt/雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)中mTORC1信号通路,进一步活化E2F通路。采用Western blot对通路相关蛋白验证,结果显示PABPC1过表达后,通路关键蛋白p-Akt(S473)(P=0.002)、p-mTOR(S2448)(P=0.008)的表达增加,E2F1上游细胞周期促进蛋白Cyclin D1(P=0.001)和p-Rb(P=0.047)表达增加、周期抑制性蛋白p21(P=0.000)和p27(P=0.004)表达减少,促凋亡相关蛋白 Cleaved Caspase-3(P=0.028)和 Bax(P=0.000)表达减少,抗凋亡蛋白Bcl-2(P=0.000)表达增多,参与细胞粘附转移的基质金属蛋白酶MMP-2(P=0.006)和MMP-9(P=0.000)表达增多。相应的,PABPC1干扰表达后相关蛋白的表达也有显著性变化(P值均小于0.05)。7.应用 1.0μM PI3K/mTOR 双向抑制 PF-04691502(PF-502)对 YT-Lv-PABP,C1 作用 24h 后较未加药组相比,p-AKT(S473)(P=0.000)和 p-mTOR(S2448)(P=0.000)蛋白表达明显减少,而t-AKT和t-mTOR则无明显变化。1.0μM PF-502对YT-Lv-PABPC1作用48h后较对照组相比,细胞周期G0/G1期显著增多(P=0.007)、S期显著减少(P=0.001),G2/M期无明显变化(P=0.404),细胞凋亡也显著增加(P=0.000),最终细胞增殖明显减慢(P=0.000)。小结1.ATF4在NKTCL细胞株中表达升高,通过与PABPC1启动子区结合促进PABPC1基因的转录。2.PABPC1可促进NKTCL细胞周期进展、减少细胞凋亡,并增加细胞克隆形成能力和迁移能力。3.PABPC1在NKTCL肿瘤细胞中通过激活PI3K/Akt/mTOR信号通路发挥促癌作用,该作用可被PI3K/mTOR抑制剂逆转。第三部分 PABPC1在NK/T细胞淋巴瘤中生物学功能及机制的体内验证方法1.使用 BALB/c 裸鼠和 YT-Lv-NC、YT-Lv-PABPC1 细胞株构建 NKTCL 裸鼠皮下移植瘤模型。2.建模成功后(即肿瘤体积达100mm3左右),将YT-Lv-PABPC1组裸鼠随机分为两组,即 YT-Lv-PABPC1/Vehicle 组和 YT-Lv-PABPC1/PF-502 组,加药组每天口服喂食PF-502(5mg/kg/day)至实验结束,其余两组(YT-Lv-NC/Vehicle和YT-Lv-PABPC1/Vehicle)给予等容量安慰剂。3.每天观察干预后各组裸鼠的一般状况,每4天测量并记录肿瘤体积。干预结束后,处死各组裸鼠,剥离肿瘤并称重。4.新鲜肿瘤组织固定、石蜡包埋后制成蜡块并切片,随后进行苏木精-伊红(hematoxylin-eosin,HE)染色,以及针对NKTCL的特有标记CD56、穿孔素(Perforin)、颗粒酶B(Granzyme B,GrB)的免疫组化染色。5.免疫组化法对各组肿瘤组织进行增殖指数Ki-67的检测,原位末端转移酶标 记法(terminal deoxynucleoitidyl transferase-mediated nick end labeling,TUNEL)对各组肿瘤组织进行凋亡的检测。6.免疫组化法对各组肿瘤组织进行PABPC1蛋白以及PI3K/Akt/mTOR通路关键蛋白p-Akt和p-mTOR的检测。结果1.在裸鼠皮下接种YT-Lv-NC和YT-Lv-PABPC1细胞株后第9天,肿瘤组织体积达100mm3左右,构建NKTCL皮下移植瘤模型成瘤率为100%。2.接种后 1 7 天起 YT-Lv-PABPCl/Vehicle 组较 YT-Lv-NC/Vehicle 组瘤体明显增大(P=0.013),接种后 21 天起 YT-Lv-PABPC1/PF-502 组较 YT-Lv-PABPC1/Vehicle组瘤体明显缩小(P=0.000)。3.接种后33天剥离移植瘤后测量瘤体湿重,YT-Lv-PABPC1/Vehicle组较YT-Lv-NC/Vehicle 组瘤重明显增加(P=0.000),YT-Lv-PABPC1/PF-502 组较YT-Lv-PABPC 1/Vehicle 组瘤重明显减轻(P=0.000)。4.肿瘤组织镜下呈现恶性肿瘤细胞的一般特征,CD56、Perforin、GrB在各组肿瘤组织中均有表达。5.YT-Lv-PABPC1/Vehicle 组较 YT-Lv-NC/Vehicle 组 Ki-67 明显增加(P=0.003),凋亡明显减少(P=0.049);YT-Lv-PABPC1/PF-502 组较YT-Lv-PABPC 1/Vehicle 组 Ki-67 明显减少(P=0.000),凋亡明显增加(P=0.000)。6.YT-Lv-PABPC1肿瘤组织中PABPC1蛋白表达较空载体组明显升高;YT-Lv-PABPC1肿瘤组织中p-Akt和p-mTOR表达较空载体组均升高,PF-502能够明显抑制过表达PABPC1肿瘤组织p-Akt和p-mTOR的表达。小结1.成功构建NKTCL裸鼠皮下移植瘤模型。2.PABPC1可通过激活PI3K/Akt/mTOR通路促进细胞增殖、减少细胞凋亡,促进NKTCL肿瘤形成。3.PI3K/mTOR抑制剂可逆转PABPC1在NKTCL中的促瘤作用。全文结论1 PABPC1在NKTCL细胞株和肿瘤组织中表达升高,PABPC1高表达是影响NKTCL患者总生存的独立不良预后因素。2ATF4在NKTCL细胞株中表达升高,并参与调控PABPC1的转录。3 PABPC1通过激活PI3K/Akt/mTOR信号通路促进NKTCL细胞株细胞周期进展、减少细胞凋亡、增加细胞克隆形成和迁移能力,并可被PI3K/mTOR抑制剂逆转。4 PABPC1通过激活PI3K/Akt/mTOR信号通路促进NKTCL裸鼠移植瘤生长,该促瘤作用可被PI3K/mTOR抑制剂逆转。