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猪伽马干扰素（porcine Interferon Gamma,pIFN-γ）属于Ⅱ型干扰素中的唯一成员,主要是由活化的T细胞和NK细胞产生的一种具有广谱抗病毒活性和免疫调节功能的细胞因子。研究和构建能高效表达具有高活性、易纯化的pIFN-γ基因工程菌,开发pIFN-γ相关药物,对于改善当前我国生猪养殖中存在的抗生素滥用、补充有效抗病毒抗肿瘤药物和提高猪肉品质具有重大意义。本研究以NCBI上公布的pIFN-γ的mRNA序列NM213948为表达基因,以甲醇营养型毕赤酵母X33为表达宿主,并对pIFN-γ基因序列进行优化,先后两次构建了pIFN-γ毕赤酵母分泌表达载体pPICZαA-pIFN-γ、pPICZαA-pIFN-γ-his tag和pIFN-γC末端突变体毕赤酵母分泌表达载体pPICZαA-pIFN-γˊ、pPICZαA-pIFN-γˊ-his tag,通过SDS-PAGE和Western-blot来分析pIFN-γ的表达情况。结果,第一次表达中得到的pIFN-γ-his tag蛋白无法经Western-blot检测与Ni亲和层析柱纯化;而第二次表达中得到的pIFN-γ肽链C末端突变体pIFN-γ′-his tag,成功通过了Western-bolt检测和Ni亲和层析柱纯化;将先后两次构建表达得到的4种蛋白,同时进行SDS-PAGE,发现四种蛋白的分子量大小关系为:pIFN-γˊ-his tag﹥pIFN-γˊ﹥pIFN-γ-his tag≈pIFN-γ。由此推测,第一次构建的pIFN-γ分泌表达载体未能分泌表达得到具有完整C端的pIFN-γ,而第二次构建的pIFN-γ突变体分泌表达载体成功分泌表达得到具有完整C端的pIFN-γ′。将本研究表达得到的pIFN-γ、pIFN-γ-his tag及其肽链C末端突变体pIFN-γˊ、pIFN-γˊ-his tag纯化后,分别与仔猪空肠上皮细胞IPEC-J2共培养,通过RT-qPCR分析受IFN-γ调控的下游基因Mx1和OAS1、以及不受IFN-γ调控的基因PKR的表达情况,比较四种蛋白对IPEC-J2细胞的刺激活性差异。结果表明,四种蛋白均能极显著的提高Mx1和OAS1的表达水平,均不能显著提高PKR的表达水平;突变后的蛋白比没突变的蛋白对Mx1和OAS1的表达水平上调幅度更大,差异极显著。由此说明,经过突变表达载体表达的pIFN-γ′比突变前具有更强的细胞刺激活性。经测定,本研究筛选得到的pIFN-γ′-his tag毕赤酵母高产菌株目的蛋白产量达到了536.4 mg/L,取得了令人满意的表达水平。综上所述,在毕赤酵母中实现pIFN-γ的分泌表达,对pIFN-γ进行C末端肽链突变改造,可以得到具有完整C端的蛋白,并可以极显著提高对仔猪空肠上皮细胞IPEC-J2的刺激活性,是十分必要的。本研究为高效、高产pIFN-γ在毕赤酵母中的分泌表达及其在生猪养殖疫病防治中的运用奠定了基础。