近年来组织工程这门新兴工程学科的发展,受到了社会各界广泛的关注。其中,水凝胶作为组织工程中一种重要的生物材料正在快速发展。水凝胶是一种由亲水性聚合物链组成并通过高分子交联而形成的材料由于其吸水性能好、具有较高的粘弹性,在多个行业已有广泛应用。与传统的体外二维细胞培养(2D培养)相比,体外三维细胞培养(3D培养)因能更好地模拟细胞外基质(ECM)而备受关注。3D培养水凝胶不仅具有良好的生物相容性,其特殊的结构性能有效模拟细胞外基质,实现细胞3D培养,而且通过智能凝胶简单的响应性,可以改变细胞生长的微环境,实现在三维空间内对细胞进行特异性的培养和研究。本实验拟采用天然蛋白质负离子多肽γ-聚谷氨酸为原材料,制备出两种不同的γ-聚谷氨酸类复合水凝胶应用于生物医药、组织工程和创伤修复等多个生物学领域,这种水凝胶最基础的功能是作为细胞支架,为细胞提供力学支撑和生长空间,因此应具备无毒害、含水率高以及良好的粘弹性等特点。γ-聚谷氨酸(γ-PGA)是由微生物发酵制备而成的氨基酸高聚物,主要来源于地衣芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌,具有较高的吸水特性且成本低廉,原料和制备过程均不会对环境造成污染。聚赖氨酸(PLL)具有一定的抗菌抑菌效果,且含有较多的氨基可与γ-聚谷氨酸产生静电作用易反应。壳聚糖(CS)来源于海洋甲壳生物中,不仅易获得,而且具有抗菌性和亲水性。1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基硫代琥珀酰亚胺(NHS),EDC是常用的蛋白质偶联剂,NHS是常用的蛋白质稳定剂。它们能够使氨基和羧基进行反应形成酰胺键,并且EDC与NHS是公认的无毒性交联剂。因此本实验采用碳化二亚胺(EDC/NHS)法以微生物发酵得到的γ-聚谷氨酸为原料主体,与聚赖氨酸、壳聚糖分别交联,利用冷冻干燥技术制孔,制备出了两种不同的γ-聚谷氨酸类复合水凝胶:γ-聚谷氨酸/聚赖氨酸(γ-PGA/PLL)复合水凝胶和γ-聚谷氨酸/壳聚糖(γ-PGA/CS)复合水凝胶,并对其理化性质、孔径大小和细胞相容性进行了系统的研究。实验通过对两种γ-聚谷氨酸类复合水凝胶的吸水率、傅里叶变换红外光谱(FTIR)、流变性能探究了其理化性质;通过扫描电子显微镜(SEM)的测试探究了两种γ-聚谷氨酸类复合水凝胶孔径随γ-聚谷氨酸浓度的变化;通过在Zen CELL owl活细胞动态成像及分析系统下软骨细胞的实时生长情况、MTT细胞毒性实验和共聚焦显微镜观察293T荧光细胞在不同浓度的两种γ-聚谷氨酸类复合水凝胶中的3D生长情况探究了其细胞相容性,其具体研究结果如下:(1)γ-聚谷氨酸类复合水凝胶的制备:以微生物发酵得到的γ-聚谷氨酸为原料主体,以聚赖氨酸、壳聚糖分别为手臂,采用碳化二亚胺(EDC/NHS)法交联,利用冷冻干燥技术制孔,成功制备出γ-聚谷氨酸/聚赖氨酸复合水凝胶和γ-聚谷氨酸/壳聚糖复合水凝胶。通过对其傅里叶变换红外光谱(FTIR)和流变性能的测试,证明了两种γ-聚谷氨酸类复合水凝胶均制备成功且具有良好的粘弹性与机械稳定性。(2)对其吸水率的测试:γ-PGA/PLL复合水凝胶的吸水率可高达1590.82%,γ-PGA/CS复合水凝胶的吸水率可高达1560.93%,证明了两种γ-聚谷氨酸类复合水凝胶均具有良好的溶胀性,并且找到了两种γ-聚谷氨酸类复合水凝胶吸水率随γ-聚谷氨酸浓度变化的吸水率曲线与方程。(3)对其扫描电子显微镜(SEM)的测试:两种γ-聚谷氨酸类复合水凝胶均找到了孔径适合细胞3D培养的水凝胶浓度。其中,γ-PGA/PLL复合水凝胶根据其孔径随γ-聚谷氨酸浓度变化的曲线,证明在γ-PGA浓度为0.0075-0.0175 g/m L之间时,其孔径符合细胞3D培养水凝胶的要求。而γ-PGA/CS复合水凝胶经多次实验证明在γ-PGA浓度为0.01475 g/m L左右时,其孔径符合细胞3D培养水凝胶要求。(4)对共聚焦显微镜、Zen CELL owl活细胞动态成像及分析系统和MTT细胞毒性实验的测试均证明了两种γ-聚谷氨酸类复合水凝胶对细胞几乎没有毒性,且在一定程度上对细胞生长有促进作用,即两种γ-聚谷氨酸类复合水凝胶均具有良好的细胞相容性。本实验成功制备出了两种以微生物发酵产物为原材料的γ-聚谷氨酸类复合水凝胶,它们均具有良好的理化性质和细胞相容性,且都找到了其适合细胞3D培养的浓度。本实验可为γ-聚谷氨酸类复合水凝胶后续的生物学应用提供一定的理论基础。