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RNA干扰(RNAinterference,RNAi)是一种强大的基因沉默技术,它的发现为了解病毒与宿主之间的相互作用提供了又一新视角,在抗病毒领域有着广泛的应用前景。猪繁殖与呼吸综合征(俗称蓝耳病,PRRS)是危害猪业生产的重大疫病之一,在全世界受到高度关注。研究表明,PRRS病毒(PRRSV)复制过程中也存在RNAi现象,并成功构建特异性靶向PRRSV基因组的高效表达shRNA质粒和病毒载体,为猪繁殖与呼吸综合征防治提供了新的探索方向。哺乳动物胚胎生物技术的日益发展及其与现代分子生物学技术的结合,使得利用遗传修饰开展转基因抗病育种成为可能。转基因克隆技术是以转基因体细胞为核供体,通过核移植生产转基因胚胎或动物的一种先进技术手段。将RNAi和转基因克隆技术相结合制备转基因动物,已被用作人类疾病的动物模型及动物抗病育种研究；但迄今尚未见到具有抗猪蓝耳病特性的相关转基因动物生产的报道。转基因克隆技术本身依然存在效率低、外源基因表达不稳定等问题。已有的研究表明,体细胞重编程过程中,DNA甲基化、组蛋白乙酰化对克隆效率和转基因表达都有直接的影响。本研究将具有抗PRRSV特性的shRNA表达盒在转基因载体进行重组与表达,在制备出适用于体细胞克隆的转基因质粒的基础上,应用克隆技术生产猪转shRNA基因克隆胚胎。通过对转基因克隆胚胎发育的研究,侧重了解曲古抑菌素A(TSA)对转基因克隆胚胎发育和相关基因表达的影响,研究其影响体细胞重编程发育的表观遗传机制；本研究所获技术方案可取得较高的转基因克隆囊胚发育率,为进一步的抗猪蓝耳病转基因育种奠定了基础。本研究共包括以下4个部分：试验1靶向PRRSV的shRNA转基因表达载体构建及其功能验证本试验旨在构建靶向PRRSV的shRNA转基因表达载体,并通过转染Marc145细胞,验证其抑制PRRSV复制的功能,为生产抗PRRSV克隆胚胎奠定基础。根据已知靶向PRRSV的pSUPER-shRNA质粒和pEGFP-N1质粒的图谱,在pSUPER-shRNA载体的shRNA表达盒上游引入EcoO1091酶切位点,再将shRNA表达盒用限制性内切酶EcoO1091切下,连接到载体pEGFP-N1对应的酶切位点,经酶切和PCR鉴定载体的正确性,结果表明成功构建靶向PRRSV的shRNA转基因表达载体pEGFP-G1;用pEGFP-G1转染Marc145细胞24h后感染欧洲型PRRSV,病毒感染后每天观察细胞病变(CPE)情况,结果表明所获pEGFP-G1可明显抑制PRRSV复制。试验2核供体细胞对猪转基因克隆胚胎体外生产的影响本试验旨在研究比较不同的核供体细胞,如猪胎儿成纤维细胞(PFF)、猪耳成纤维细胞(PEF)、猪PK-15细胞,在体外传代培养过程中获得稳定转染shRNA的细胞克隆作为供核细胞对克隆胚胎发育的影响,筛选出体外生产转shRNA基因克隆胚胎的最佳核供体。对原代猪胎儿成纤维细胞分别采用组织块与胶原酶消化2种方法分离培养,结果表明,采用组织块法分离培养的PFF,形成细胞单层的时间为5～7d,而采用胶原酶消化法3d就可以获得细胞单层；组织块培养猪耳成纤维细胞需要5～7d才始大量生长,形成单层需要9～10d。用pEGFP-G1分别转染PFF,PEF和PK-15,经600μg/mLG418筛选获得稳定转染shRNA的细胞克隆并扩大培养；再以稳定转染shRNA的PFF. PEF和PK-15细胞进行核移植,比较其对猪克隆胚胎生产效率的影响,结果表明以转染shRNA的PFF为核供体所构建的克隆胚胎,囊胚发育率要显著高于其他2组(26.6%对12.9%和0%；P<0.05)。本试验表明,以体外长期传代培养的PK-15作为核供体细胞并未获得囊胚发育,而分离培养的PFF、PEF作为供核细胞使用均可获得囊胚发育,其中以PFF为供核细胞时,可获得最佳的转基因克隆囊胚发育率。试验3猪转基因克隆胚胎体外发育的研究本试验旨在研究不同培养液、激活方法及曲古抑菌素A (TSA)对猪转基因克隆胚胎体外发育的影响。用NCSU-23和PZM-3两种培养基分别对猪孤雌激活胚胎进行培养,结果表明两组的卵裂率虽然无显著差异(72.1%对75.0%,P>0.05),但囊胚发育率差异显著(20.9%对33.3%),表明PZM-3具有更佳的胚胎发育效果。比较电激活和电激活加6-DMAP两种激活方式证明,两组囊胚发育率差异不显著。用50nM TSA分别处理供核细胞(A组)和核移植重构胚(B组),或同时处理供核细胞和重构胚(C组),并设不作TSA处理的对照组(D组),结果表明用TSA处理重构胚(B、C组)要比单纯处理供核细胞(A组)和对照组可获得更高的转基因克隆囊胚发育率(分别为33.0%和35.7%对15.8%和20.0%；P<0.05),仅用TSA处理供核细胞并不能提高囊胚发育率。试验4曲古抑菌素A影响猪转基因克隆胚胎发育的机理研究为了评估供核细胞和重构胚的表观遗传修饰对转基因克隆胚胎重编程发育的影响,探讨转基因克隆胚胎发育调控的机理,采用组蛋白去乙酰化酶抑制剂TSA分成4组处理：A组50nM TSA在核移植操作前处理供核细胞24h,B组50nM TSA处理激活后重构胚24h,C组供核细胞与重构胚均用TSA处理,D组不作TSA处理设为对照组。对各组所获转基因克隆胚胎不同发育阶段的组蛋白H3K9乙酰化水平(AcH3K9),组蛋白去乙酰化基因Hdac1mRNA表达水平、甲基化相关基因Dnmt1mRNA表达水平、多能性相关基因Oct4mRNA表达水平、抗凋亡基因Bcl-2mRNA表达水平及外源基因(EGFP)表达水平进行比较,结果表明TSA处理供核细胞并未影响转基因克隆胚胎的乙酰化水平,但处理重构胚可明显提高2-细胞胚乙酰化水平,并提高囊胚发育率。用TSA处理重构胚,可有效增加4-细胞胚胎和囊胚Oct4mRNA的表达,刺激Bcl-2mRNA的表达,并降低Dnmt1mRNA的表达。在外源基因的表达上,TSA处理供核细胞或重构胚均可较对照组增加EGFP表达,TSA处理似乎具有阻止外源基因沉默的作用。本试验表明,TSA处理可能通过提高猪转基因克隆胚胎组蛋白乙酰化和抗凋亡能力来促进其体外发育。本试验是体外生产抗猪蓝耳病转基因克隆胚胎的首次报道,为进一步开展猪转基因抗病育种奠定了基础。