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杜洛克猪自引入我国以来,经过多年驯化饲养,现已成为品种改良繁育的优质品种。然而,在不同季节杜洛克猪精液质量特性差异较大,尤其在夏季,精液体积和精子活力急剧下降,但夏季影响精液质量特性的分子机制尚未明确。因此,本研究运用蛋白质组学技术从能量代谢、氧化应激以及蛋白质翻译后修饰等方面探究夏季影响精子质量的分子机制,旨在为杜洛克猪精液质量特性的提升提供理论指导。本研究主要分为以下几方面工作:1、分析了蛋白磷酸化和乙酰化修饰水平与精子活力之间的相关性。利用Western-blot技术和细胞免疫荧光技术分析了新鲜精子和体外保存过程中精子的磷酸化和乙酰化修饰水平,并利用R软件分析了蛋白磷酸化和乙酰化修饰水平和精子活力之间的相关性。结果表明,新鲜精液中高活力精子的P-PKAs、PTP、Pan-Kac以及Tub-Kac水平均显著高于低活力精子;另外,随着体外保存时间的延长,精子的P-PKAs、PTP、Pan-Kac以及Tub-Kac水平也逐渐降低。R软件统计分析表明,在新鲜精液中,精子的P-PKAs水平(r=0.634,P<0.01)和Pan-Kac水平(r=0.380,P<0.05)与精子的活力呈显著正相关;在体外保存过程中,只有P-PKAs水平(r=0.607,P<0.01)与精子活力呈显著正相关。2、分析了夏季和冬季时精液的质量特性。利用CASA和流式细胞仪分析了冬夏季精液的常规质量参数及精子的结构完整性。结果表明,夏季时,精液的体积、精子活力、曲线运动速率和直线运动速率均显著低于冬季(P<0.05),而精子密度却显著高于冬季(P<0.01)。另外,夏季时精子的质膜完整性、顶体完整性以及线粒体膜电位也显著低于冬季(P<0.01)。3、本研究运用Label-Free串联质谱技术定量分析了夏季和冬季精子、精清和精清外泌体的蛋白组成。分别从精子、精清和外泌体中鉴定出95种、97种和88种差异表达蛋白。生物信息学分析表明,夏季上调的蛋白(如,HSPA2、GSTP1、GAPDH、ALPL和ZPBP)主要参与热应激、氧化应激、能量代谢和蛋白质翻译后修饰等;而夏季下调的蛋白(如ARSA、MUC20和CDH1)则主要涉及精子的受精过程、细胞粘附和蛋白质磷酸化等。由此推测,精子的能量代谢、氧化应激及蛋白质翻译后修饰等方面的差异或许是造成精子在夏季和冬季时质量特性差异的重要原因。4、为了验证上述推测结果的可靠性,本研究又探究了夏季和冬季精子的ATP含量、活性氧含量(ROS)、丙二醛含量(MDA)、总抗氧化活性(T-AOC)以及蛋白磷酸化和乙酰化修饰水平。结果表明,夏季精子的ATP含量及T-AOC活性显著低于冬季(P<0.05);而ROS和MDA含量则显著高于冬季(P<0.01)。另外,精子的P-PKAs、PTP、Pan-Kac和Tub-Kac水平也均显著低于冬季。综上所述,夏季影响精子质量特性的主要原因如下:一方面,夏季时,精子遭受剧烈的热应激和氧化应激,产生过量的ROS,造成精子结构完整性的破坏和线粒体膜电位的降低,使精子ATP合成受阻,导致精子活力下降;另一方面,夏季时,精子蛋白磷酸化和乙酰化修饰水平的降低也是导致精子活力降低的另一个重要原因。