目的建立高效的EV71病毒反向遗传学系统,通过转染和侵染两种不同的方式快速获得拯救病毒并鉴定其活性,同时对两种获得病毒的方式进行对比并探讨其特点与优势。方法1.先构建含有人RNA聚合酶I启动子(Ppol I)、ccdB自杀基因和鼠终止子(mTer)的接收质粒pHT-ccdB,并在ccdB两侧引入AarI酶切位点;为了回避EV71病毒基因组中自身的AarI酶切位点,分两段PCR扩增基因组,在引物中引入必需的AarI酶切位点,通过Golden Gate clone法连接到目的载体中获得病毒拯救质粒pHT-EV71,转染至RD细胞后,获得拯救的EV71病毒,并以RT-PCR、病毒滴度、Western blot、以及电镜检测等方法鉴定拯救子代病毒。2.将已构建病毒拯救质粒pHT-EV71转化到DAP营养缺陷型的大肠杆菌Sw106感受态中,随机挑出12个较大的菌落进行培养,将获得的菌液直接侵染到RD细胞中,收集出现CPE现象的RD细胞上清,获得拯救病毒,并以RT-PCR、病毒滴度、Western blot、以及电镜检测等方法鉴定拯救子代病毒。3.将转染和侵染两种方式获得的拯救病毒和野生毒株通过病毒增殖、生长曲线和Western blot等方式进行毒力的对比,总结和初步探讨两种获得方式的特点。结果1.通过引入ccdB致死基因和改良的Golden Gate Clone方法成功构建了EV71病毒的拯救质粒pHT-EV71。2.将拯救质粒pHT-EV71通过转染和侵染两种方式从RD细胞中均能观察到明显的致细胞病变效应,得到的拯救子代病毒EV71-Rescue和EV71-Rescue2,经EV71VP1的特异性引物进行RT-PCR扩增,观察到长约1900bp的特异性条带;Western blot结果显示,拯救病毒均可与EV71 VP1特异抗体结合;透射电子显微镜检测可见20~30 nm球形病毒颗粒;在RD细胞中将子代病毒连续增殖8代后,转染获得的EV71-Rescue和侵染获得的EV71-Rescue2的毒力均高于母本株。3.通过生长曲线比较两种方式获得的拯救病毒的增殖趋势,并与野生毒株的生长复制能力进行对比,结果显示EV71-Rescue和EV71-Rescue2增殖稳定,连续传代后滴度都能达到8 lgTCID50/mL以上;EV71-Rescue和EV71-Rescue2与野生毒株具有相似的生长复制趋势。结论1.通过引入ccdB和Golden Gate Clone技术,成功的建立了快速、高效构建EV71病毒的拯救质粒的方法,效率达到100%,为正链RNA病毒反向遗传学系统的构建提供了一种新的策略。2.通过传统的转染方式成功的获得了拯救病毒,还成功的通过新的侵染方式获得了更高效的拯救病毒。3.通过将两种方式获得的拯救病毒与野生毒株的特性对比,证明侵染方式是一种更为高效的获取拯救病毒的方式,为进一步研究EV71病毒的致病机制及疫苗制备等提供了技术平台。