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【目的】观察ZHX1在D-半乳糖诱导的耳蜗毛细胞株OC-1拟老化模型中的表达情况,初步探讨ZHX1在老年性聋发病过程中可能的作用及机制。【方法】(1)耳蜗毛细胞株用不同浓度梯度的D-半乳糖作用48h,CCK-8检测细胞活性,筛选出15mg/ml的浓度来建立拟老化模型。(2)按照不同的处理方式进行以下分组:1)C组:对照组,用普通培养基培养48h,不做特殊处理;2)D组:D-半乳糖组,用浓度为15mg/ml的D-半乳糖培养基培养48h;3)NC组:转染阴性对照组,与目的基因序列无同源性,转染6h后,改用15mg/ml D-半乳糖培养基继续培养48h;4)Si组:ZHX1沉默组,含目的基因ZHX1的si RNA,转染6h后,改用15mg/ml D-半乳糖培养基继续培养48h。(3)分别使用光学显微镜和透射电镜观察细胞的形态和超微结构;RT-PCR检测线粒体DNA缺失率(CD);Annexin V-PI匹配使用,检测细胞凋亡率;DCFH-DA探针作标记,检测细胞内活性氧含量;JC-1探针法检测细胞线粒体膜电位,并用共聚焦显微镜进行观察;酶标仪比色法检测GSH、MDA、ATP的含量,及SOD、CAT的活力;RT-PCR检测P16、P21、ZHX1、TWIST1、Bcl-2、NRF-1的m RNA表达水平;Western blot检测ZHX1、Bcl-2、Bax、caspase-3、NRF-1的蛋白表达水平。【结果】(1)透射电镜的结果显示,C组的细胞外形规则,胞膜完整,胞质均匀致密,含有丰富的细胞器,线粒体和内质网的结构完整、清晰;D组的细胞外形欠规则,有较为明显的内陷,核膜完整性被破坏,出现核碎片,细胞质疏松紊乱,细胞器结构变形,线粒体嵴减少、肿胀,甚至出现空泡。(2)D组的CD缺失率较C组升高,P16和P21的m RNA表达水平上调。(3)D组的细胞活性氧含量较C组升高。(4)D组和NC组的细胞凋亡率较C组升高,Si组较NC组升高。(5)D组和NC组的线粒体膜电位水平较C组降低,Si组较NC组降低。(6)D组和NC组的SOD、CAT活力及GSH、ATP含量均较C组降低,MDA含量升高;Si组与NC组比较,SOD、CAT活力和GSH、ATP含量降低,MDA含量升高。(7)RT-PCR检测m RNA表达水平,D组和NC组的ZHX1、TWIST1、Bcl-2和NRF-1的表达水平均较C组降低,Si组的ZHX1、Bcl-2和NRF-1的表达水平较NC组降低,TWIST1的表达水平则无明显区别。(8)Western blot检测蛋白表达水平,D组和NC组的ZHX1、NRF-1的表达水平较C组降低,Bcl-2/Bax比值降低,活性caspase-3的表达水平升高,Si组与NC组比较,ZHX1、NRF-1的表达水平降低,Bcl-2/Bax比值降低,活性caspase-3的表达水平升高。【结论】(1)在一定时间内给予耳蜗毛细胞株高浓度的D-半乳糖处理,可使细胞内活性氧含量增多,CD缺失率升高,P16和P21表达水平上调,细胞超微结构出现退行性改变,说明我们成功建立体外耳蜗毛细胞株的拟老化模型。(2)用si RNA可以有效干扰ZHX1的表达,影响细胞凋亡和氧化应激的进程,ZHX1可能在耳蜗毛细胞株的衰老过程中起保护作用。(3)ZHX1可能通过调节Bcl-2和NRF-1的表达水平发挥作用。