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肝癌是我国常见的恶性程度较高的肿瘤之一,其发病率和死亡率高居世界前列,每年肝癌的新发病例和死亡病例约占全球总数的一半。目前肝癌的治疗以手术为第一选择和主要治疗手段,术后复发依然是导致患者死亡的主要原因,肝癌根治性切除术后5年转移复发率高达50%-70%以上,因此,肝癌术后休眠是近来研究热点。中医在该领域有着巨大的优势,应用中医药促进肝癌休眠、预防肝癌术后复发提高患者生存质量和生存时间意义重大。“健脾化瘀方”是我们科室临床肝癌术后的经验方剂,集健脾益胃、化瘀散结、清热解毒、理气化湿于一体,扶正祛邪,攻补兼施。而关于中医药促进肝癌休眠机制,尚不明确,根据相关研究,B7-H1/PD-1通路介导的免疫抑制性微环境可能是肝癌休眠的重要机制,而miRNA-570能够显著的抑制人胃癌SGC-7901细胞和人乳腺癌MDA-MB-435细胞中B7-H1的表达,因此,我们猜测健脾化瘀方可能通过miRNA-570调控B7-H1/PD-1通路在肝癌术后细胞休眠中发挥重要作用。目的：体外研究探讨健脾化瘀方对肝癌细胞侵袭和转移的抑制作用,通过miRNA570对B7-H1/PD-1通路的调控抑制肝癌细胞的生长、增殖、侵袭,促进其凋亡,体内研究证实健脾化瘀方对肝癌休眠的促进作用。方法：首先,通过qRT-PCR检测及Western bolt检测筛选出miRNA570表达最低、B7-H1蛋白表达最高的人源肝癌细胞株HepG-2作为实验对象,慢病毒转染miRNA570, qRT-PCR检测验证转染效率,并构建野生型和突变型B7-H13’UTR的psi-check2载体,Western bolt检测B7-H1蛋白的表达,荧光素酶活性检测miRNA570在野生型和突变型的psi-check2载体中的表达,MTT检测0、24、48、72、96小时的转染miRNA570后的HepG-2细胞,观察增殖情况,Transwell检测转染miRNA570后的HepG-2细胞迁移情况,流式细胞术检测转染miRNA570后的HepG-2细胞的凋亡情况,用B7-H1蛋白逆转miRNA570的作用进行验证；然后,采用CCK8法观察不同浓度健脾化瘀方对人源肝癌细胞株HepG-2细胞增殖的影响,通过数据分析得出IC50值(半抑制浓度),Transwell实验观察健脾化瘀方的半抑制浓度对人肝癌细胞株HepG-2细胞侵袭的影响,采用流式细胞术观察健脾化瘀方的半抑制浓度对人肝癌细胞株HepG-2细胞早期凋亡的诱导情况；最后,建立裸鼠腋下肝癌模型,通过肿瘤切除手术,诱导建立术后肝癌休眠模型,随机分为正常对照组、健脾化瘀方低剂量、中剂量和高剂量组,反复行截尾外伤刺激,予生理盐水、高、中、低剂量中药分别灌胃进行干预,观察裸鼠一般情况,并记录肿瘤生长情况,了游标卡尺测量裸鼠肿瘤组织的最长径(a)及垂直最短径(b),并按照v=1/2ab2公式,计算出肿瘤的体积,研究健脾化瘀方促进肝癌休眠作用。结果：(1) Western blot检测得出在正常的肝细胞株L-02和HL-7702以及肝癌细胞株Bel-7404, Huh-7, HepG2中B7-H1蛋白的表达,肝癌细胞株HepG2中B7-H1蛋白的表达最高(p<0.05)。 qPCR检测可以得出在正常肝细胞株L-02和HL-7702以及肝癌细胞株Bel-7404, Huh-7, HepG2中miRNA-570的表达水平,肝癌细胞株HepG2中1niRNA-570的表达最低(p<0.05)。(2) miRNA570与B7-H1/PD-1通路的负反馈调控机制：HepG2细胞慢病毒转染miRNA-570, qPCR检测转染后miRNA-570与NC组比较有明显的升高,分别构建野生型和突变型B7-H1 3’UTR的psi-check2载体,Western blot检测B7-H1蛋白的表达,得出转染miRNA-570后的HepG2细胞B7-H1的表达明显下降,mRNA水平上qPCR检测转染miRNA-570后的B7-Hl表达与NC组无明显差异,荧光素酶活性检测野生型的psi-check2载体中miRNA-570的表达与突变型的psi-check2载体相比明显降低(2倍)(p<0.05). MTT检测在0、24、48、72、96 h的细胞,miRNA-570高表达的HepG2细胞与NC组相比增殖明显减弱(p<0.05),Transwell检测miRNA-570高表达的HepG2细胞的迁移下降,侵袭能力降低(p<0.05),流式细胞检测miRNA-570高表达的HepG2细胞凋亡明显增多(p<0.05)。构建B7-H1过表达载体,即HepG2-miR-570+B7-H1, HepG2-miR-570+Vector为对照组,共转染miR-570和过表达载体,Western blot检测B7-H1的表达水平,MTT检测HepG2细胞在培养0、24、48、72、96 h后的增殖水平,流式细胞检测HepG2细胞的凋亡,Transwell检测HepG2细胞的迁移能力(p<0.05) 。(3)健脾化瘀方对HepG2细胞的抑制作用：CCK8结果表明健脾化瘀方对人肝癌细胞株HepG-2细胞的增殖用抑制作用,但有一定的浓度依赖性,同一时间不同浓度细胞的生长抑制率明显降低(p<0.05),数据分析得出IC50值为6.8872mg/ml。Transwel1实验结果表明健脾化瘀方的半抑制浓度作用HepG-2细胞24小时,HepG-2细胞的侵袭能力降低(p<0.05)。流式细胞检测结果表明健脾化瘀方的半抑制浓度作用HepG-2细胞48小时,HepG-2细胞凋亡明显增多(p<0.05)。(4)建立裸鼠肝癌术后休眠模型,在反复的外伤刺激下,空白对照组休眠率为0,中药低、中剂量组的休眠率分别为80%和60%。结论：健脾化瘀方对肝癌细胞的增殖和侵袭有明显的抑制作用,诱导肝癌细胞的凋亡,促进肝癌术后休眠,可能与miRNA570与B7-H1/PD-1通路在肝癌细胞中的负反馈调控有关。