肾小管间质纤维化是多种慢性肾脏病发展到终末期肾衰的共同途径。它以过量细胞外基质在肾间质积聚及肾间质成纤维细胞增生为特征。肾间质纤维化的发生过程中，36％的新增纤维细胞来源于肾小管上皮细胞.间充质细胞转分化(Epithelial-mesenchymaltransition，EMT)，提示EMT在肾小管间质纤维化过程中起重要作用。因此探讨EMT的发生发展机制是目前亟待解决的重要课题。 EMT包括4个步骤：(1)细胞连接破坏，上皮细胞失去粘附能力；(2)α-SMA等间充质细胞标志的表达；(3)肾小管基底膜破坏；(4)细胞迁移和侵袭能力增强。其中，细胞间连接的破坏是上皮细胞转分化的始动环节。 LNX(Ligand-of-NumbproteinX)是新近发现的一个泛素连接酶(E3)。晚近研究发现某些泛素蛋白连接酶可以介导细胞连接的组成蛋白泛素化，过表达相应的E3可以破坏细胞间的连接；如Hakai可特异性识别E-钙黏素而导致其从胞膜转移至胞内并使之降解，从而促进EMT。LNX同属E3，已知其可发挥连接酶的作用而经泛素-蛋白酶体途径降解命运决定因子Numb；但其确切生理功能目前了解甚少。 本课题组前期工作发现LNX是定位于细胞连接处的泛素连接酶。那么，LNX对细胞连接的形成和维持有无影响?是否会通过对细胞连接的影响从而对EMT产生某种影响? 本研究主要目的是观察LNX对上皮细胞间连接的影响；了解LNX对肾小管上皮细胞转分化的作用及可能的机制；从而进一步揭示EMT的发生机制，为临床防治肾小管间质纤维化提供新靶点。 本研究的主要内容包括： 1.通过构建四环素诱导LNX稳定表达的MDCK细胞株，观察LNX对上皮细胞间连接的影响。 2.观察LNX对TGF-β1刺激人肾小管上皮细胞转分化的影响；若LNX对EMT确实存在作用，则进一步探讨其酶活性是否是影响EMT的关键因素。 一、LNX表达对上皮细胞间连接的影响 目的：阐明泛素连接酶LNX在维持上皮细胞之间连接的作用。 方法：构建四环素诱导表达LNX的MDCK细胞株；以免疫荧光法观察细胞连接蛋白E-钙黏素和ZO-1在细胞内的分布；透射电镜观察上皮细胞间连接的超微结构；钙离子转换实验检测黏附连接的形成。 结果：发现LNX的表达使E-钙黏素和ZO-1在细胞内的分布发生明显改变，大量E-钙黏素和ZO-1聚集在胞浆中，而细胞膜上的分布则明显减少；透射电镜观察上皮细胞间连接的超微结构显示，LNX的表达导致紧密连接和黏附连接的正常结构消失；钙离子转换实验显示表达LNX的MDCK细胞间的黏附连接形成速度明显滞后于正常细胞。 小结：LNX的表达影响了E-钙黏素在细胞膜上的正常分布，从而延迟黏附连接复合体的形成，导致上皮细胞间连接结构的异常。 二、wtLNX表达对TGF-β1刺激人肾小管上皮细胞转分化的影响。 目的：观察wtLNX对TGF-β1刺激人肾小管上皮细胞转分化的影响。 方法：人肾小管上皮细胞(HK-2)分为空载体组和wtLNX瞬时转染组，给予TGF-β1(浓度梯度)刺激24h后，分别用realtime-PCR，WesternBlot和免疫荧光方法以及Transwellassay检测HK-2发生EMT的情况。 结果：无TGF-β1诱导下，wtLNX的表达并不导致细胞发生EMT；但是当给予TGF-β1诱导后，相比于空载体组，LNX的表达使HK-2细胞上皮细胞的标志蛋白E-钙黏素表达降低更为明显，间叶细胞的标志如波形蛋白表达显著增加，细胞外基质成分纤维连接蛋白以及具有抑制基质溶解作用的PAI-1表达亦显著上调；而且，细胞的迁移能力明显增强。上述结果从EMT的几个主要环节证实wtLNX表达可以促进TGF-β1诱导的肾小管上皮细胞转分化。 小结：wtLNX可促进TGF-β1诱导的肾小管上皮细胞转分化，该作用很可能与其破坏细胞连接的结构有关。 三、wtLNx的酶活性对EMT的影响 目的：观察wtLNX的酶活性与wtLNX促进TGF-β1诱导EMT的相关性。 方法：人肾小管上皮细胞(HK-2)分为野生型LNX(wtLNX)转染组以及无酶活性LNX(C48ALNX)转染组，给予TGF-β1刺激24h后，分别用WesternBlot和Transwellassay检测HK-2发生EMT的情况。 结果：在TGF-β刺激下，相比于空载体组，wtLNX和C48ALNX转染组肾小管上皮细胞的E-钙黏素表达均明显受抑制，波形蛋白表达均增加，纤维连接蛋白以及具有抑制基质溶解作用的PAI-1表达也都显著上调；而且两组细胞的迁移能力均明显增强；提示wtLNX以及无酶活性LNX转染均可促进TGF-β1诱导的EMT。但是比较两者促进EMT程度的作用，发现两者间并无差异。 小结：wtLNX促进TGF-β1诱导的肾小管上皮细胞转分化的发生不依赖于其连接酶活性。 总结： 1.wtLNX在上皮细胞中的表达可以导致E-黏素、ZO-1在胞浆中聚集，影响细胞连接的形成，引起上皮细胞间连接结构的异常。 2.wtLNX可能通过破坏细胞间的连接结构而促进TGF-β1诱导的肾小管上皮细胞转分化，这一作用并不依赖其泛素连接酶的活性。