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糖类化合物是构成生命体的基本物质之一。在生物体内,糖类化合物可以单糖、寡糖以及多糖等形式存在,也能够与蛋白质、脂质形成糖蛋白、糖脂等糖缀合物,参与细胞识别、激素调节、受精、发生、发育、分化等多种重要生命过程。糖类化合物的结构复杂多样,不同的结构形式存在的糖类化合物具有不同的功能。因而糖类化合物的合成以及结构解析对研究糖类化合物的生物功能具有重要的意义。糖苷酶,又称糖类水解酶(glycosidase,glycoside hydrolase,EC 3.2.1),是生物体内专司糖类水解的酶类。在体外,某些糖苷酶还能利用适合的供体与受体催化糖苷的合成反应。糖苷酶催化糖苷合成的反应条件温和,不需要有机溶剂的参与,食品药品安全性高。糖苷酶种类广泛,各自有水解或合成的偏好性,合成的产物构型、链型多样,在糖苷合成中占有重要位置。α-L-岩藻糖苷酶是一类参与岩藻糖代谢的水解酶类,根据序列相似性以及底物水解特异性可分为两个糖苷水解酶家族(glycoside hydrolase families)GH95以及GH29。α-1,2-L-岩藻糖苷酶(EC 3.2.1.63)专一性水解α1,2键,为构型翻转酶,归属为GH95家族。α-l,3/4-L-岩藻糖苷酶(EC 3.2.1.111)专一性水解α1,3、α1,4键,不能水解人工底物(p-nitrophenyl-α-L-fucoside,Fuc-α-pNP,pNPF),为构型保持酶,归属为GH29-B亚家族;还有一类水解键型范围广泛的酶,能够水解pNPF,统称为α-L-岩藻糖苷酶(EC 3.2.1.51),为构型保持酶,归属为GH29-A亚家族。由于水解机制以及对pNPF的水解活性的限制,只有GH29-A家族的α-L-岩藻糖苷酶能够直接利用pNPF作为转糖基反应的供体催化岩藻糖苷的合成反应。人类血型糖链、N-糖苷、O-糖苷、人类母乳寡糖(human milk oligosaccharides,HMO)以及一些肿瘤细胞表面糖链均存在岩藻糖基化现象。岩藻糖基化对这些糖链的功能有着重要的意义。已有研究证明,岩藻糖基化丰富的寡糖具有特殊的免疫原性,能够有效的引起抗含Globo H的小鼠肿瘤细胞系LLC1的抗体介导的细胞免疫应答。目前,研究者们已经利用细菌或其它来源来源的岩藻糖苷酶来合成岩藻糖基化寡糖,但是合成产物的种类以及合成效率上仍存在不足。所以,需要继续筛选具有高转糖基活性的α-L-岩藻糖苷酶,以期获得更有效的合成岩藻糖基化寡糖的工具酶。本论文对Bacteroides fragilisNCTC 9343中的5个α-L-岩藻糖苷酶进行了分子克隆、底物水解特异性以及转糖基活性研究。筛选到了 2种具有转糖基活性的α-L-岩藻糖苷酶BF29A2以及BF29A4,并对这2种酶进行酶学性质以及转糖基性质研究。根据 CAZY(http://www.cazy.org/GH29.html)预测,B.fragilii的 13 个 α-L-岩藻糖苷酶可分别归属为GH95和GH29两个大家族。本论文分析了 4个GH95家族酶与已报道的GH95家族酶的序列相似性,并进行了序列比对以及催化位点的分析。将属于GH29家族的9个酶与已有报道GH29家族的α-L-岩藻糖苷酶进行了序列比对以及发育进化树分析,并进一步将属于GH29家族的酶分为GH29-A以及GH29-B亚家族两个小组。本论文最终成功表达了归属于GH95的1个酶(BfAfc3)以及 GH29-A 亚家族的 4 个酶(BF29A1、BF29A2、BF29A4、BF29A5),并研究了其底物特异性。GH95家族的BfAfc3对α1-2键型表现出最高的水解活性,为α-1,2-L-岩藻糖苷酶;GH29-A亚家族的4个酶中,BF29A1只能够水解pNPF,不水解天然底物;BF29A2能够水解α1-2/3/4岩藻糖苷键,但最适底物为pNPF;BF29A4的水解键型广泛,其中对α1-3以及α1-6键型、pNPF 水解活性表现出最高;BF29A5能够水解岩藻糖基化寡糖及pNPF,其中对α1-3键型表现出最高的水解活性。在转糖基活性研究中发现,只有GH29-A亚家族的BF29A2、BF29A4具有转糖基活性。BF29A2对人工底物pNPF动力学常数Km为10.18 mM,最大反应速率为0.72nM/min。反应最适pH为5.5-6.5,在pH 5.0-11.5范围内稳定。反应最适温度为40℃,温度低于40℃时稳定。同时,BF29A2的水解活性受Zn2+、Fe3+离子激活,受Ag+、Cu2+以及Hg2+的抑制。本论文选择以pNPF做为BF29A2的供体,乙酰氨基半乳糖(GaINAc)为受体进行转糖基活性研究。通过供受体浓度、pH、温度以及反应时间对转糖基反应影响的优化后,BF29A2的总转糖基产率最高可达到 53%。通过质谱(mass spectrum,MS)与核磁共振(nuclear magnetic resonance,NMR)分析后可知产物构型为异头碳构型不同、键型相同的两种产物,产物结构式为 Fucαl-3GalNAc。BF29A4 对 pNPF 的 Km 为 0.86 mM,最大反应速率为 4.51 nmol/min。与 BF29A2相比,BF29A4对pNPF亲和力高,水解速率快。BF29A4的最适pH为5.5-7.5,在pH5-11范围内稳定;最适温度为45℃,在温度低于45℃时稳定。BF29A4的水解活性虽不受任何所测离子的激活,但却受Ca2+、Ni2+、Ag+、Fe3+、Hg2+以及EDTA的抑制。本论文选择以pNPF做为BF29A4的供体,乙酰氨基葡萄糖(GlcNAc)为受体进行转糖基活性研究。通过高效液相色谱分析发现,BF29A4的转糖基产物为两种连接键型不同的同分异构体,分别命名为product1和product2。通过供受体浓度、pH、温度以及反应时间对转糖基反应影响的优化,BF29A4的总转糖基产率最大可达到79%。两种转糖基产物的比例随pH值、温度的变化而变化。在酸性条件下(pH 4.5-6.5),product1的产率较低,与product2的最大比例约为p1:p2 = 0.3:1(pH6.0)。而在碱性条件下,product1的比例逐渐上升,与product2的最高比例约为p1:p2 = 0.7:1(pH8.0)。不仅如此,温度对两种酶产物比例的影响也很显著。低温利于product2的合成,20℃时,两种产物比例约为p1:p2 = 0.1:1;高温利于product1的合成,50℃时,二者比例为p1:p2 =1.7:1。通过质谱以及离子色谱分析后可知,product1为Fucα1-3GlcNAc,product2为 Fucα1-6GlcNAc。