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研究目的:乳腺癌是目前全球女性较常见的恶性肿瘤之一,其发病率位居女性恶性肿瘤的首位。但是迄今为止我们对乳腺癌的疾病发生发展的机制研究并不详细,大量已有数据显示乳腺癌的发生发展与细胞内的多种信号通路异常的转导密不可分。转化生长因子(Transforming Growth Factor beta,TGFβ)信号通路就是其中之一。目前研究表明肿瘤发展至晚期TGFβ则会呈现出促进肿瘤恶化的趋势,而截短型神经激肽1受体(Truncated Neurokinin 1 Receptor,NK1R-Tr)在晚期乳腺癌中表达升高有促癌作用,但是有关两者的关系及它们与肿瘤的相关性研究较少。在本研究中,我们收集了乳腺癌组织及癌旁组织样本检测了TGFβ和NK1RTr的表达,探究癌组织中TGFβ和NK1R-Tr表达差异以及他们与预后的关系,同时分析了两者的相关性。随后我们用乳腺癌细胞系进一步研究二者细胞内信号通路的调控以及他们对细胞增殖、周期和凋亡等功能表型的影响,本研究结果可为乳腺癌的早期诊断和治疗提供另一新的思路。研究方法:1.乳腺癌临床病理组织样本TGFβ和NK1R-Tr的表达选取来源于天津医科大学肿瘤医院乳腺肿瘤科50例乳腺癌组织及癌旁组织样本,其临床诊断均经病理学检验证实。采用免疫组化染色和Western Blot检测癌组织和癌旁组织样本中TGFβ和NK1R-Tr的表达量,同时统计分析TGFβ和NK1R-Tr在癌组织样本与预后的关系及两者表达的相关性。2.TGFβ对NK1R-Tr介导的乳腺癌细胞增殖功能的影响乳腺癌细胞在敲除NK1R或加入NK1R拮抗剂后分别加入TGFβ刺激,采用CCK8实验和克隆形成实验检测TGFβ和NK1R-Tr对细胞生长增殖的影响。同时Western Blot分析增殖相关通路的变化。3.TGFβ对NK1R-Tr介导的乳腺癌细胞生长周期的影响在乳腺癌细胞中敲除NK1R或加入NK1R拮抗剂后,分别加入TGFβ刺激,采用流式细胞术检测TGFβ和NK1R-Tr对细胞生长周期的影响。同时我们分析了各个时期细胞分布变化,以及Western Blot分析相应细胞周期相关蛋白的变化。4.TGFβ对NK1R-Tr介导的乳腺癌细胞凋亡的影响在乳腺癌细胞系中分别敲除NK1R或加入NK1R拮抗剂后,分别加入TGFβ刺激后用Annexin V/PI染色技术检测TGFβ和NK1R-Tr对肿瘤细胞凋亡的影响。然后我们对与细胞凋亡有关的通路相关蛋白的变化进行Western Blot分析。5.构建动物模型观察TGFβ和NK1R对乳腺癌细胞成瘤的影响通过在MDA-MB-231细胞中分别构建TGFβ高表达、NK1R降表达及NK1R降表达同时TGFβ高表达的细胞系,将其注射于裸鼠的皮下,每周测量肿瘤的体积,32天后将裸鼠统一处死,并取出肿瘤,测量肿瘤的大小和重量进行统计学分析比较各组的差异。6.乳腺癌细胞中TGFβ对NK1R-Tr的表达调控在加入TGFβ刺激后分别在不同时间点检测细胞内NK1R-Tr在m RNA和蛋白水平的表达变化。同时,通过免疫荧光技术观察加入TGFβ刺激前后细胞内其下游信号通路中重要分子Smad4的定位变化。7.乳腺癌细胞中TGFβ对NK1R-Tr的调控机制研究我们预测到Smad4在NK1R启动子区有结合位点,则通过染色质免疫共沉淀和双荧光素酶报告基因检测技术证实Smad4对NK1R启动子活性的调控作用,再通过敲除Smad4后检测TGFβ对NK1R-Tr的调控作用是否发生变化。研究结果:1.乳腺癌临床病理组织样本TGFβ和NK1R-Tr的表达在对比临床组织样本后发现,和癌旁组织相比乳腺癌组织中TGFβ和NK1RTr表达水平升高。高表达TGFβ和NK1R-Tr的患者其生存期明显低于低表达的患者,说明高表达组预后更差。在人乳腺癌组织中TGFβ和NK1R-Tr的表达呈正相关。2.TGFβ通过调控NK1R-Tr促进乳腺癌细胞的增殖在乳腺癌细胞中,敲除NK1R或加入NK1R抑制剂后,会减弱TGFβ对细胞增殖的影响,下游ERK和AKT的磷酸化水平减弱。3.TGFβ通过调控NK1R-Tr改变G2/M期细胞比例在乳腺癌细胞中,敲除NK1R或加入NK1R抑制剂后,乳腺癌细胞在G2/M期的比例明显增加,细胞周期蛋白cyclin B1表达下降,P21蛋白的表达上升,TGFβ加入后可减弱该作用。4.TGFβ通过调控NK1R-Tr抑制了乳腺癌细胞的凋亡在乳腺癌细胞中,敲除NK1R或加入NK1R抑制剂后,乳腺癌细胞的凋亡明显增加,凋亡相关蛋白Caspase-3的活性增加,Bcl-2的表达下降。5.TGFβ和NK1R促进了乳腺癌细胞成瘤能力相比对照组而言,TGFβ高表达能促进小鼠肿瘤的生长,截短型NK1R降表达能抑制肿瘤的生长。截短型NK1R降表达能减弱TGFβ对肿瘤的促进作用6.TGFβ对NK1R-Tr的表达调控在MDA-MB-231和BT549两个细胞系中加入TGFβ刺激后,NK1R-Tr的m RNA和蛋白水平表达逐渐增加。但是在敲除Smad4后截短型NK1R的m RNA和蛋白水平表达下降。并且TGFβ刺激会导致Smad4入核增加。7.乳腺癌细胞中Smad4参与了TGFβ对NK1R-Tr的调控TGFβ处理后Smad4与NK1R启动子的结合能力增强,同时荧光素酶的活性也有所增加,敲除Smad4后NK1R荧光素酶报告基因的活性减弱。研究结论:本研究中,乳腺癌组织中TGFβ和NK1R-Tr表达水平较高,两者表达呈正相关且与患者不良预后有关。TGFβ可通过Smad4调节NK1R-Tr的表达,以此来促进细胞的增殖,抑制细胞的凋亡。因此,我们的研究主要探究了在乳腺癌中TGFβ对截短型神经激肽1受体表达的调控作用以及对乳腺癌细胞的功能影响,希望能为乳腺癌的早期诊断和治疗提供另一新的思路。