目的1.利用高通量测序结合临床大数据分析肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)病人不同疾病进程中肠道菌群及肠型差异,在微生物层面筛选HCC标志物,建立特有预测模型从微生物组学水平评估HCC病人的预后。2.探索构建模型中高权重蛋白——纤维蛋白原γ链(FGG)在HCC疾病进程中的临床意义和生物学作用方法1.采集健康人(n=20例)和HCC病人术前(n=91例)、术后(n=82例)、术后复发(n=15例)的粪便样本,利用二代测序技术检测肠道菌群中的16srRNA序列,结合生物信息学方法筛选HCC不同疾病进程中发生高频改变的肠道菌属和肠型变化。利用统计学方法分析其与临床病理特征及预后的关系。2.以第一部分研究入组病人为研究对象,借助HCC临床大数据平台采集临床变量信息,构建全维度数据集,以基于机器学习理论的XGBoost算法构建HCC术后转移复发风险预测模型1(简称模型1);结合二元逻辑回归算法对全维度临床变量进行降维以构建降维数据集,同前法使用降维数据集构建模型2;将肠型分类变量纳入降维数据集生成综合数据集,同前法使用综合数据集构建模型3。通过预测准确率、ROC曲线比较上述各模型的预测效果,分析其高权重变量。3.在24对和35对肝癌及配对癌旁组织中分别利用免疫印迹(Western Blot)和荧光定量聚合酶链反应(RT-qPCR)检测FGG的表达情况。然后在被确诊的79例HCC石蜡切片样本中,利用免疫组化检测FGG的表达,分析其与临床病理因素及预后的关联。分别构建过表达和敲减FGG的SK-HEP-1细胞株,利用细胞划痕和Transwell实验观察FGG对细胞迁移和侵袭能力的影响,利用Western blot检测上皮-间质转化(epithelial mesenchymal transition,EMT)相关表型标志物(E-cadherin、N-cadherin)和转录调控因子(Slug、Zeb1)的表达,并对潜在调控机制进行验证。结果1.通过Alpha多样性分析显示健康人群肠道菌群的物种多样性高于HCC病人;而术后HCC病人肠道菌群的物种多样性较术前和术后复发时升高、菌群结构改善,且趋近于健康人群特征;而在术后复发时病人菌群的物种多样性再次降低,趋近于术前荷瘤状态。表明肠道菌群的物种多样性与HCC病人的荷瘤状态密切相关。通过Beta多样性分析结果同样显示健康人群与HCC病人的菌群组成差异较大,与之前结果一致。另外,从门、纲、目、科、属逐层分析发现:当术前组、术后组、复发组和对照组相互比较时,物种分布存在部分与病程改变相契合的差异,具有进一步研究的价值。因此,我们通过Lefse分析和物种绝对丰度分析再次将对照组和肝癌术前组的菌群进行比较,分别筛选出10个和17个差异物种。结合已有报道,本研究鉴定出的差异菌属Verrucomicrobia、Akkermansia、Bacteroides、Dialister可能在HCC发生发展中发挥作用。利用相同的分析策略比较肝癌术前组和肝癌术后组,分别筛选到20个和9个差异物种。其中肝癌术后组的有益物种丰度趋于增加、有害物种丰度趋于减少,并且这种趋势与疾病状态改变一致,表明肝癌术后组肠道菌群趋向健康人群发展。由于有15例病人,完整收集其术前、术后、术后复发粪便样本,因此,我们再次利用物种绝对丰度分析,共发现5个差异物种。其中差异菌属Blautia的丰度随肿瘤形成、切除、复发呈现减少、增多、减少的显著负相关变化,提示其可能是一种有益菌,这与其它消化系统肿瘤中的研究结论一致。2.肠型分析可以直观地体现肠道菌群的结构和组成差异,一般分为三种肠型:肠型1(E1)、肠型2(E2)、肠型3(E3)。本研究对肝癌术前、术后组样本进行肠型分析显示,入组病人的肠型均为E1和E2,而特异性缺失E3肠型。临床病理分析表明,术前E1/E2肠型分类与术后复发显著相关,而术后肠型分类与临床病理因素均不相关。与术前E1肠型病人相比,术前E2肠型的HCC病人的无瘤生存时间较短。3.分别使用全维度数据集、降维数据集和综合数据集构建的模型1、模型2、模型3对肝癌术后复发的预测准确率为72.22%、85.00%、89.48%,ROC曲线AUC值分别为0.8312、0.9471、0.9819。添加了肠型分类变量的模型3预测精度最高。模型3变量依权重值排序从高到低为α-岩藻糖苷酶(AFU)、纤维蛋白原、术前+术后肠型(组合)、术中失血量、肿瘤大小、年龄、术前E1/E2肠型等。其中纤维蛋白原是预测模型中权重最高的几个因素之一,提示可能与肝癌的发生、恶化密切相关。4.肝癌组织中FGG表达高于癌旁肝组织。FGG高表达与卫星灶、大血管侵犯、微血管侵犯以及更高的TNM分期显著相关;中高表达FGG的HCC病人无瘤生存时间和总体生存时间均较短。FGG高表达是影响肝癌术后复发的独立危险因素。体外细胞实验表明,FGG过表达可显著增强SK-HEP-1细胞的体外迁移和侵袭能力;而相反,FGG表达沉默可显著抑制SK-HEP-1细胞的迁移侵袭能力。机制研究表明,FGG通过调控ZEB1和slug的表达,诱发EMT进程,促进HCC的迁移和侵袭。结论1.肠道菌群的物种多样性与HCC疾病状态呈负相关。Blautia可能作为一个有益菌参与了HCC进展的过程,其可能作为一个辅助判断其恶性进程及预示其复发的微生物指标。术前肠型分类可能是一个潜在的肝癌术后复发相关指标。2.运用XGBoost算法构建HCC术后转移复发风险预测模型成功,增加肠型分类变量可使预测准确率更高。纤维蛋白原作为模型中权重值第2位的临床变量,具有很好的临床实用价值,值得进一步深入研究。3.FGG在HCC组织中表达水平较高,其表达水平与术后复发和不良预后密切相关。FGG通过激活EMT,促进HCC细胞的迁移和侵袭,是一个潜在的HCC预后生物标志物。