论文部分内容阅读
小GTP结合蛋白在真核细胞中参与信号转导、细胞增殖、细胞骨架重组和细胞内的膜运输等多种过程。这些蛋白质的功能作为分子开关周期性调节激活和失活状态，该循环被链接到GTP结合和水解之间。在木本植物中，对毛果杨中的小G蛋白家族进行测序有114个成员，分4个亚家族，其中Rab达66个占成员总量的57%。另外，毛果杨小G蛋白家族成员比拟南芥多21个，这种差异可能是在暗示杨树中的小G蛋白家族在功能上的特异性。本试验是对杨树PtRabA2f基因功能的深入研究。通过RT-PCR方法从毛果杨cDNA中扩增得到PtRabA2f基因，ORF片段大小为651bp。在构建植物表达载体的时候,本实验选择了使用GateWay技术。先将目的基因RabA2f与pENTR-SD-D-TOPO中间载体连接，得到中间载体pENTR-RabA2f；再通过置换的方式将RabA2f连接到质粒pGWB2上形成pGWB2-RabA2f,利用农杆菌介导法分别转到毛果杨、拟南芥中，通过筛选鉴定获得PtRabA2f超表达体系毛果杨、拟南芥。通过对比WT、pGWB2和T2-PtRabA2f-5拟南芥生长状况，在正常平板中T2-P-5组拟南芥长势明显较好，显示出鲜重重、植株高、叶片鲜亮且较大、根长长等特点，在逆境胁迫下其长势、根长和鲜重均优于pGWB2组和WT组，受胁迫影响小。检测毛果杨RabA2f基因表达特性，以Actin1基因作为内标基因。使用半定量PCR方法。分别在200mmol/L NaCl、8％PEG、200mmol/L甘露醇、干旱、10mmol/LH2O2胁迫下，与对照相比PtRabA2f基因的表达水平呈现明显的上升状态且每一时间段都高于WT组和pB2组，在24h表达量最高。NaCl胁迫处理24h时，T0-PtRabA2f-3型杨树表达量为WT型的3.54倍；甘露醇胁迫处理24h时，T0-P-3型杨树表达量为WT型的1.36倍；H2O2胁迫处理24h时，T0-P-3型杨树表达量为WT型的2.77倍；PEG胁迫处理24h时，T0-P-3型杨树表达量为WT型的2.37倍；干旱胁迫处理24h时，T0-P-3型杨树表达量为WT型的2.5倍。对WT、pB2和T2-PtRabA2f-5组拟南芥各反应时间测其GTP水解能力变化，结果显示当处于90min时GTP水解能力最大。分别在80mmol/LNaCl、8％PEG、200mmol/L甘露醇、10mmol/LH2O2胁迫处理0h、2h、12h、24h时测其GTP水解能力变化。结果显示T2-PtRabA2f-5超表达体系拟南芥比野生型拟南芥水解程度高。在80mmol/LNaCl下：T2-PtRabA2f-5组拟南芥叶绿素含量在24h到144h时呈下降趋势,并在144h时达到最低值，T2-P-5在144h比对照提升了15.35%、在168h比对照提升了17.34%，差异显著。在8％PEG下：T2-P-5组在144h比对照提升了25.31%、在168h比对照提升了26.64%，差异显著。在200mmol/L甘露醇下：T2-P-5组在144h比对照提升了24.43%、在168h比对照提升了25.99%，差异显著。在10mmol/LH2O2下：T2-P-5在168h比对照提升了36.33%，差异显著。以上结果表明，转PtRabA2f基因拟南芥品系在胁迫条件下叶绿素含量更为稳定受胁迫影响较小。在80mmol/LNaCl下：T2-PtRabA2f-5组拟南芥电导率比WT和pB组电导率值小，变化缓慢随着时间延长这种趋势更明显，T2-P-5组的电导率含量在24h比对照降低了6.01%、在168h比对照降低了29.81%，差异显著。在8％PEG下：T2-P-5在24h比对照降低了6.25%、在168h比对照降低了27.54%，差异显著。在200mmol/L甘露醇下：T2-P-5在24h比对照降低了6.34%、在168h比对照降低25.21%，差异显著。在10mmol/LH2O2下：T2-P-5组在48h比对照降低了4.62%、在168h比对照降低了28.67%，差异显著。以上结果表明，转PtRabA2f基因拟南芥品系在胁迫条件下电导率含量更为稳定受胁迫影响较小。