研究目的:癫痫(Epilepsy)是最常见的也是最严重的神经系统疾病之一。癫痫是一种以癫痫发作为特征的神经障碍,是大脑异常放电的结果。癫痫的主要好发人群为儿童和老年人。据统计,约有50%的癫痫发生在儿童和老年人群中,而其中的一半发生在不满一岁的婴幼儿身上。在2015年,全世界约有3900万人被诊断为癫痫,且导致1.25万人死亡。目前该病的治疗主要以药物控制癫痫发作为主,并辅助以生活饮食的管理。但目前为止,还未能有一种理想的抗癫痫药能够有效地控制癫痫的发作,并不会对智力、兴奋性能、运动功能、情绪或其它方面造成损伤。考虑到传统抗癫痫药物的应用局限性,以及其不可忽视的副作用,科学家们仍需不断开发更为有效的且副作用相对较小的新型抗癫痫药物。传统中药通常被认为是一种温和而安全的草药。传统中药是由天然植物萃取或合成的,其功效可代替人工合成的药物。在中国,用中药治疗癫痫有着悠久的历史。《中国药典》中记载的具有抗癫痫功效的中草药就有23种,包括:青阳参、黄芩、天麻、柴胡、黄连等。这些药物被认为是治疗癫痫的安全药物,几乎没有发现有明显的副作用。桔皮素(Tangeretin,分子式:C20H20O7;分子量:372.37)是一种O型聚甲氧基黄酮。其主要来源于芸香科川橘(Citrus nobilis Lour.)的果皮、酸橙(C.aurantium L.)的果皮、以及柑橘(C.reticulata Blanco.)的叶和茎。桔皮素的多种生物活性作用已被广泛报道,其中主要包括:增强胰岛素的分泌,调节肝酶的活性,以及降低链球菌诱发的血糖升高。此外,桔皮素还具有显著的抗炎抗氧化功能以及心血管和肾脏保护功能。近年来,有部分研究学者发现,桔皮素亦具有一定的神经保护作用,其可用于阿尔茨海默症和帕金森综合征的预防和治疗。但据我们所知,目前桔皮素对于癫痫的作用仍未被广泛研究。本实验研究了桔皮素对癫痫大鼠海马神经元损伤的作用,同时检测了神经元中凋亡蛋白和金属基质蛋白表达的变化。本文旨在分析桔皮素对于癫痫大鼠海马神经元的保护作用,以及探寻其深层的分子机制,为阐明桔皮素的抗癫痫机制提供一定的理论依据。实验方法:第一部分桔皮素对氯化锂-匹鲁卡品致痫大鼠海马神经元损伤的影响本实验使用清洁级成年雄性Wistar大鼠30只,分为5组(n = 6每组):正常对照组(Control),癫痫模型组(Pilocarpine,PL),桔皮素低剂量治疗组(PL+ 50mgTangeretin),桔皮素中剂量治疗组(PL + 100mgTangeretin),和桔皮素高剂量治疗组(PL+200mgTangeretin)。其中,癫痫模型组中大鼠腹腔注射3 mmol/kg氯化锂进行预处理,24 h后皮下注射1 mg/kg氢溴酸东苠菪碱(避免匹鲁卡品引起的外周胆碱能反应),30min后腹腔注射30mg/mL匹鲁卡品。桔皮素治疗组大鼠腹腔注射3 mmol/kg氯化锂进行预处理,24 h后腹腔注射50 mg、100 mg或200 mg桔皮素,30 min后皮下注射1 mg/kg氢溴酸东莨菪碱,30 min后腹腔注射30 mg/mL匹鲁卡品。经过处理的大鼠海马组织被分离。我们对海马组织进行脱水、石蜡包埋以及切片,用于Nissl染色以及末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记测定(terminal dexynucleotidyl transferase(TdT)-mediated dUTP nick end labeling,TUNEL)。第二部分桔皮素通过调控凋亡蛋白表达及PI3K/AKT通路抑制氯化锂-匹鲁卡品致痫大鼠神经元的凋亡经过处理的大鼠海马组织从大鼠体内分离后,利用RIPA裂解液对海马组织总蛋白进行提取。并用核蛋白抽提试剂盒和线粒体蛋白抽提试剂盒分别对海马组织核蛋白和线粒体蛋白进行提取。利用western blot方法检测各蛋白抽提液中凋亡相关蛋白以及PI3K/AKT信号通路中关键蛋白的表达变化。第三部分桔皮素抑制氯化锂-匹鲁卡品致痫大鼠神经元中金属基质蛋白酶MMP-2和MMP-9的表达利用Trizol试剂提取海马组织中总RNA。应用荧光定量PCR方法检测海马组织中MMP-2与MMP-9的基因表达变化。同时,利用western blot和明胶酶谱分析法检测组织中MMP-2与MMP-9蛋白表达水平以及活性。结果:第一部分桔皮素对氯化锂-匹鲁卡品致痫大鼠海马神经元损伤的影响Control组的Wistar大鼠无任何癫痫发作症状,其它四组的大鼠均有不同程度的癫痫发作症状。与PL组相比,桔皮素治疗明显的降低了大鼠癫痫发作程度。PL组癫痫首次发作的潜伏期为11.02 ± 1.50 min,而PL + 50 mg Tangeretin组为18.15±1.45 min,PL + 100 mg Tangeretin 组为 25.2 ± 2.05 min,PL+ 200 mg Tangeretin组为33.5±1.20 min,桔皮素治疗明显延长了大鼠首次癫痫发作的潜伏期。PL组大鼠达到IV级发作的潜伏期为34.10 ± 1.50 min,而桔皮素治疗组同样延长了大鼠癫痫Ⅳ级发作的潜伏期。PL + 50 mgTangeretin组潜伏期为41.15 ±1.25 min,PL + 100 mg Tangeretin 组为 48.20 ± 2.05 min,PL + 200 mg Tangeretin组为50.5 ±1.20 min。此外,与PL组相比,桔皮素治疗显著的降低了大鼠的死亡率(p<0.05)。通过Nissl染色实验,我们观察到Control组海马wCA3区神经元呈现带状分布,锥体细胞及颗粒细胞排列紧密,结构清晰完整,形态正常,胞核呈圆形或椭圆形。PL处理组海马神经元间距明显增大,排列疏松,细胞肿胀,轮廓模糊,界限不清,部分神经元胞体皱缩,出现明显的神经元损伤情况。而桔皮素治疗明显降低了海马神经元损伤情况。各组大鼠海马神经元CA3区存活的神经元数目结果显示,PL组大鼠CA3区神经元存活的数目明显低于Control组。然而,桔皮素治疗组大鼠CA3区神经元存活的数目明显高于PL组(p<0.05)。TUNEL染色结果显示,PL处理组中海马CA3区TUNEL阳性细胞显著高于Control组。桔皮素治疗组中TUNEL阳性细胞明显低于PL处理组,且呈浓度依赖性(p<0.05)。第二部分桔皮素通过调控凋亡蛋白表达及PI3K/AKT通路抑制氯化锂-匹鲁卡品致痫大鼠神经元的凋亡Western blot 结果显示,PL 组中 Bad、Bax 以及 Cleaved-caspase-3 的蛋白表达水平明显高于其在Control组的蛋白表达,而Bcl-2和Bcl-xL的蛋白表达水平明显降低(p<0.05)。然而,与PL组相比,桔皮素治疗组明显增加了 Bcl-2和Bcl-xL的蛋白表达水平,但是降低了 Bad、Bax和Cleaved-caspase-3的蛋白表达水平(p<0.05)。凋亡相关因子蛋白的表达水平的升高与降低受桔皮素浓度的影响,呈浓度依赖性。PL组中海马组织细胞核中的凋亡诱导因子(apoptosis-inducing factor,AIF)的蛋白表达水平明显高于Control组,而海马组织线粒体中的AIF蛋白表达水平明显低于Control组。相较于PL组,桔皮素治疗组海马组织细胞核中的AIF蛋白表达水平明显降低,而线粒体中的AIF蛋白表达水平明显升高。PL +200 mg Tangeretin处理组的变化最为明显。磷酸化的AKT和GSK-3β蛋白表达水平在PL组中明显降低,而AKT的负调控因子磷酸酯酶(phatase and tensin homology deleted on chromosome 10,PTEN)的蛋白表达水平显著升高。此外,AKT的下游靶蛋白mTORcl和cyclinD1的蛋白表达水平在PL组明显下调(p<0.05)。然而,与PL组相比,桔皮素治疗组明显上调了磷酸化的AKT和GSK-3β以及mTORcl和cyclinD1的蛋白表达水平,但是降低了 PTEN的蛋白表达水平,这些变化呈浓度依赖性(p<0.05)。第三部分桔皮素抑制氯化锂-匹鲁卡品致痫大鼠神经元中金属基质蛋白酶MMP-2和MMP-9的表达荧光定量PCR电泳结果显示,匹鲁卡品注射12h后,PL组中MMP-2和MMP-9的mRNA表达水平与Control组相比变化不明显。桔皮素治疗组中MMP-2的mRNA表达水平与PL组相比无明显的趋势变化,但是MMP-9的mRNA表达水平明显高于PL处理组。匹鲁卡品注射24h后,PL组中MMP-2和MMP-9的mRNA表达水平明显高于Control组,而桔皮素治疗组中MMP-2和MMP-9 mRNA的表达水平与PL组相比无明显变化。Western blot实验结果显示,匹鲁卡品注射12 h后,PL组中MMP-2和MMP-9蛋白表达水平明显升高,而桔皮素治疗组中MMP-2和MMP-9蛋白表达水平显著下降。同样地,匹鲁卡品注射24h后,MMP-2和MMP-9的蛋白表达水平在PL处理组明显上调,而在桔皮素治疗组明显下调。此外,MMP-2和MMP-9的蛋白表达水平在不同组处理12 h后的变化明显高于处理24 h后的变化。明胶酶谱实验结果显示,与Control组相比,在匹鲁卡品注射12 h后,PL组中MMP-2和MMP-9的活性明显增强(p<0.05)。而与PL组相比,桔皮素治疗组中MMP-2和MMP-9的活性明显降低(p<0.05)。在匹鲁卡品注射24 h后,桔皮素治疗组中MMP-2和MMP-9的活性与上述结果类似,PL组MMP-2和MMP-9的活性显著升高,不同浓度桔皮素处理组MMP-2和MMP-9的活性明显降低。结论:1.桔皮素能够有效延缓氯化锂-匹鲁卡品致痫大鼠癫痫发作的潜伏期,降低致痫大鼠的死亡率;2.桔皮素能够减轻氯化锂-匹鲁卡品致痫大鼠海马神经元的损伤,并且抑制海马神经元凋亡;3.桔皮素通过降低AIF核转位并激活PI3K/AKT信号通路,保护大鼠海马神经元;4.桔皮素能够降低氯化锂-匹鲁卡品致痫大鼠海马组织中MMP-2和MMP-9的表达和活性,缓解癫痫的症状。