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由禾谷镰孢菌(Fusarium graminearum)引起的小麦赤霉病是小麦生产上最重要的真菌病害之一,除了造成减产和品质下降外,禾谷镰孢菌产生的毒素残留在谷物内造成粮食污染,对全球的粮食生产安全造成严重威胁。在真核生物中,SNARE(soluble N-ethylmaleimide-sensitive factor attachment protein receptor)蛋白在胞吞运输及细胞膜的融合过程中具有重要的作用。我们前期研究发现,SNARE蛋白FgVam7通过参与禾谷镰孢菌的囊泡运输过程调控其胞吞和外泌,从而调控该病菌的生长发育、DON(deoxynivalenol)的产生和致病过程。本文在此研究基础上通过免疫共沉淀(co-IP)的方法鉴定FgVam7的结合蛋白,并解析结合蛋白的生物学功能,从而揭示FgVam7参与调控禾谷镰孢菌生长发育及致病力的分子机制。主要研究结果如下:1.FgVam7结合蛋白的鉴定本实验室前期研究发现,SNARE蛋白FgVam7通过调控禾谷镰孢菌的胞吞过程进而影响该病菌的生长发育、DON的产生和致病力。但是其调控这些生物学表型的分子作用机制仍不清楚,为了进一步解析FgVam7通过与哪些蛋白质相互作用进而调控禾谷镰孢菌的生物学表型。我们利用免疫共沉淀的方法鉴定FgVam7的结合蛋白。通过对结合蛋白的质谱结果进行分析,鉴定到21个FgVam7候选结合蛋白。利用酵母双杂交技术(Yeast two hybrid)对候选蛋白进行一对一互作验证,结果显示其中13个候选蛋白和FgVam7相互作用;8个蛋白质和FgVam7不相互作用。生物信息学分析发现这些互作的蛋白质主要包括囊泡运输相关蛋白、自噬相关蛋白、生物体代谢相关蛋白和一些假定蛋白,提示FgVam7相互作用的蛋白可能通过控制禾谷镰孢菌不同的生理生化进程,进而参与调控禾谷镰孢菌的生长发育和致病力。结合我们前期研究中发现的FgVam7通过调控胞吞过程进而影响该病菌的的生长发育、DON的产生和致病力的研究结果,我们选择囊泡运输相关的蛋白进行进一步的研究,研究结果可望为深入了解FgVam7分子作用机制提供理论依据。2.FgVps39参与囊泡运输过程调控禾谷镰孢菌生长发育和致病力采用酵母双杂交技术对FgVam7候选结合蛋白进行一对一互作验证,发现HOPS复合物的亚基FgVps39和FgVam7相互作用。在生物体内,HOPS复合物主要参与晚期内涵体向液泡的运输过程。缺失FgVPS39导致病原菌的生长减慢,有性生殖能力丧失,DON毒素减少和致病力丧失。亚细胞定位揭示FgVps39参与从早/晚期内涵体向液泡运输的囊泡运输过程。此外,缺失FgVPS39导致禾谷镰孢菌液泡融合出现缺陷进而影响其胞吞和细胞自噬过程。进一步采用酵母双杂交和GSTpull-down技术发现FgVam7、FgVps39和SNARE蛋白FgSso1相互作用,它们三者之间形成一个复合物。上述结果表明FgVam7、FgVps39和FgSso1相互作用形成复合物参与调控禾谷镰孢菌囊泡运输进程从而影响其生长发育和致病力等生物学过程。3.FgVps41调控细胞膜的融合和蛋白质的转运进而影响禾谷镰孢菌的生长发育和致病力采用酵母双杂交技术对FgVam7候选结合蛋白进行一对一互作验证,发现HOPS复合物的另外一个亚基FgVps41和FgVam7相互作用。通过对其编码的基因进行敲除发现FgVps41对禾谷镰孢菌的营养菌丝的生长、无性繁殖、有性生殖、致病力和DON毒素的产生具有重要作用。进一步分析发现,FgVps41通过和小G蛋白FgRab7直接作用被FgRab7招募到内涵体和液泡膜上,随后FgVps41在液泡膜上被蛋白激酶FgYck3磷酸化进而发挥功能,暗示FgVps41调控内涵体向液泡的运输过程。上述结果表明,FgVps41通过控制细胞膜的融合和蛋白质的转运,影响病原菌向胞内传递寄主表面信号的过程,进而调控禾谷镰孢菌的生长发育和致病力。4.T-SNARE蛋白FgPep12在禾谷镰孢菌生长发育和致病过程中的功能分析采用酵母双杂交技术对FgVam7候选结合蛋白进行一对一互作验证,发现SNARE蛋白FgPep12和FgVam7相互作用。利用基因敲除的方法对FgPEP12进行敲除,发现FgPep12参与调控禾谷镰孢菌营养菌丝的生长、无性繁殖、致病力和毒素的产生,但不影响禾谷镰孢菌的胞吞过程。亚细胞定位观察揭示FgPep12定位在早/晚期内涵体和液泡,提示其在囊泡融合过程中具有重要的作用。实验结果表明,FgPep12通过参与囊泡运输过程参与调控禾谷镰孢菌的生长发育和致病过程。