研究背景与目的α-地中海贫血(thalassemia,简称“地贫”)是全球最常见、对人类健康影响最大的单基因遗传病之一,主要集中在地中海沿岸国家、东南亚、少数非洲地区和我国南方,保守估计全世界携带者近2亿人,其中我国南方广西、广东、、四川等省份和地区的人群携带率分别高达17.55%、8.53%、1.92%。此病目前缺乏有效治疗手段,应用相应分析技术通过人群筛查及产前诊断阻止重症患儿出生是国内外公认的首选预防措施。由于此病的普遍性和严重性,世界上地贫受累国家及地区,已相继实施了以降低地贫重症患儿出生率为目标的人群预防措施。人类α-珠蛋白基因簇位于16号染色体上,有ξ、α1、α2三个功能基因,表达相应的ξ和α珠蛋白链,再与相应的p珠蛋白链结合,形成ξ2γ2(胚胎期血红蛋白Hb Portland)和α2β2(成人血红蛋白HbA)。正常情况下,人类珠蛋白基因所表达的α类和β类珠蛋白链比例适当,形成具有功能的血红蛋白四聚体。当α珠蛋白基因缺陷,使α链合成减少而β链相对过剩即是α-地贫发病的分子机制。导致α链合成减少的基因缺陷主要(>95%)是α珠蛋白基因缺失,其缺失数目是α-地贫临床表现及分型的依据。在α-地贫分子诊断临床实践中,Southern Blot杂交技术准确性高,但操作繁琐、标本用量大、费时费力、检测通量小而不适合常规检测；目前常规使用的gap-PCR技术,必须逐一定性检测各已知缺失类型,工作量大、检测通量小,并且存在未知新缺失类型的假阴性、外源污染导致的假阳等技术瓶颈。近几年来,虽然一些新技术已相继应用到缺失型α-地贫的分子诊断,在方法学研究方面有一定进展,但基本上都是以gap-PCR定性技术为基础,尚无实质性突破,分子诊断方法的操作可行性、检测通量等方面仍不能满足当前大规模人群筛查及常规分子诊断的需要。α-地贫的发病机制是α珠蛋白基因缺失,任何一种分子诊断方法的最终目的都是为了确定α珠蛋白基因的缺失情况。通过逐一定性检测各种缺失类型而间接推导功能基因缺失情况的gap-PCR技术,自然存在假阴性和假阳性、难以实现高通量规模化检测等技术瓶颈。随着地贫预防计划与措施的相继实施及其分子机制与分子流行病学的深入研究,准确可靠、简单实用、能实现自动化和标准化、适合大规模人群筛查和常规分子诊断的高通量检测技术与方法,是满足当前进行α-地贫大规模人群筛查的公共医疗卫生需要,也是当前地中海贫血分子诊断技术研究领域所面临的新挑战。本研究的目标即是建立一种缺失型α-地贫分子诊断新途径与新方法,有效解决目前所存在的假阴性和假阳性等技术瓶颈,准确可靠、简单实用、高通量低成本,适合当前缺失型a-地贫大规模人群筛查和常规分子诊断。研究方案与方法根据缺失型a-地贫的发病机制及分子基础,只要能准确分析α珠蛋白基因的缺失及缺失数目,也就能准确诊断缺失型α-地贫。就一套人类正常基因组而言,α珠蛋白基因型为ε2/α12/a22,即各有两个拷贝；另外,人类基因组中的某些看家基因(HKGs),如GAPDH等,没有拷贝数变异,任何情况下都是2个拷贝。那么,在一正常个体基因组标本中的,α珠蛋白基因与看家基因的拷贝数是相等的。如果某个体a珠蛋白基因缺失了其中1个,则此珠蛋白基因的拷贝数就只有HKG的一半；反之,如果某一α珠蛋白基因三拷贝,则其拷贝数就是HKG的1.5倍。所以,只要采取相应的技术,准确检测这种相对拷贝数比例,也就能准确分析α珠蛋白基因的缺失情况,而实现缺失型α-地贫的快速分子诊断。据此方法学研究策略,本研究具体实施了以下研究方案与方法。1.利用实时荧光定量PCR技术,以GAPDH为参比基因,ξ、α1、α2为目的基因,采用ΔCt值法相对定量方式,同时分析ξ、α1、α2基因相对拷贝数。实时荧光PCR技术,可准确定量被检标本中目的DNA序列的拷贝数,其依据是每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数线性关系,起始拷贝数越多,Ct值越小。对于一正常标本,α珠蛋白基因与GAPDH的拷贝数相等,两者的Ct值的差异(ΔCt)恒定；如果被检个体为缺失了某一a珠蛋白基因的地贫携带者,其α珠蛋白基因拷贝数减少1倍而Ct值增高幅度为1,则与GAPDH的ΔCt值增大幅度也为1,所计算的2-ΔΔCt值为0.5,也就说明目的基因与参比基因的相对拷贝数比例为0.5。从理论及数据分析原理上,可根据这种相对定量方式准确分析目的基因的缺失及缺失数目。2.建立一种四重TaqMan实时定量荧光PCR体系,实现ξ、α1、α2珠蛋白基因的相对拷贝数同步分析。所采用的ΔCt值相对定量方式,是基于固定体积和固定浓度gDNA标本中目的基因和参比基因拷贝数的比例。为消除单独分管检测时,由于各管加入模板量的差异而导致的检测Ct值误差,本研究建立四重定量PCR体系,在同一加入模板量、同一扩增条件下检测目的基因和参比基因。另外,为保证四重PCR体系的高特异性及高扩增效率,采用先低退火温度合成检测模板、再以高退火温度进行检测的预扩增模板处理措施。3.四重TaqMan实时定量荧光PCR体系的全面优化。参照相关文献,2-ΔΔCt值数据分析的ΔCt值相对定量方式,必须保证目的基因和参比基因的PCR扩增效率高、且基本一致。在验证了GAPDH、ζα1、a2基因DNA序列引物的特异性以后,对此四重PCR体系的引物及探针浓度、PCR Buffer浓度、镁离子浓度、检测模板量等体系组份,进行一系的优化与调整。通过扩增效率分析和扩增效率一致性评价,确定四重TaqMan实时定量荧光PCR优化体系。4.新诊断方法用于缺失型α-地贫分子诊断的灵敏度与准确性评价。遗传病的实验室分子诊断方法,是应用一定的检测体系,而达到预期的诊断目的,故分子诊断方法建立的步骤中,检测体系的优化是前提,灵敏度与准确性的评价是关键。本研究先收集了12例经gap-PCR检测和Southern Blot验证的已知基因型gDNA标本,根据缺失类型推导ζ、α1、α2基因的相对拷贝数,并以此为靶值,然后将新体系检测所获得相对拷贝数与之进行比较；随后又收集了218例经gap-PCR检测的已知基因型gDNA标本,同样进行相对拷贝数检测值与靶值的比较分析。通过对此230例已知基因标本的检测,以全面评价新诊断方法用于缺失型α-地贫分子诊断的灵敏度与准确性。5.诊断方法的缺失型α-地贫人群筛查初步评价。为当前缺失型α-地贫大规模人群筛查提供简单实用的分子诊断方法,是本研究的目标之一,为初步评价新诊断方法用于缺失型α-地贫人群筛查的实用性与可行性,本研究收集了104份随机人群gDNA标本,应用新诊断方法及gap-PCR法同时进行检测,然后将检测结果进行比较,并对子分析实验操作具体情况。6.诊断方法的大样本盲法分析评价。准备了546份表型资料齐全、浓度100-300ng/μl、OD260/280>1.55、已采用gap-PCR检测本地区常见α-地贫缺失类型的gDNA标本,对其盲法编号后,应用新诊断方法进行检测分析；然后对比分析相对拷贝数检测结果,对于结果不相符的标本,再用gap-PCR或/和MLPA进行对比检测,以全面评价新诊断方法进行缺失型α-地贫及α-珠蛋白基因CNVs分子诊断的灵敏度、准确性及实用性。研究结果根据研究目标及研究策略,通过实施具体研究方案与方法,所获得的研究结果如下：1。建立了稳定可靠的四重TaqMan实时定量荧光PCR体系。此体系中,所选取的扩增目的DNA序列、以及所设计的引物,经验证,其特异性可靠。所采用的模板预扩增处理措施切实可行。2.确立了四重TaqMan实时定量荧光PCR优化体系。经一系PCR反应体系及反应条件优化与调整,及扩增效率及扩增一致性评价,所确立的优化体系为总反应体积20μl,含1.5xPCR Buffer、7mmol/L Mg2+、75nmol/L/每对引物浓度、100nmol/L/每条探针浓度、1μ Ex Taq酶、100-300ng gDNA、 0.2mmol/L dNTPs,以95℃预变性5 min→3cycles (94℃30sec+ 52℃20sec) (92℃10sec+62℃45sec并检测荧光信号)的扩增条件进行检测。在这种优化条件下,ζ、α1、α2.GAPDH基因的扩增效率分别为101.8%、102.8%、102.8%、102.0%,均接近100%：ξ、α1、α2目的基因的扩增效率一致性分析曲线的斜率分别为0.0005、0.0013和0.0032,均接近于0；说明此多重体系的扩增效率高且基本一致,符合2-ΔΔCt相对定量要求。3.新方法诊断缺失型α-地贫的灵敏度与特异性均达到100%。230例(12+218)经gap-PCR或/和Southern Blot检测的已知基因型标本,应用新方法进行检测,所获得的α珠蛋白基因相对拷贝数结果与靶值相符。4.新方法操作简单、检测快速、结果稳定可靠,适合缺失型α-地贫大规模人群筛查。缺失型α-地贫人群筛查的初步评价实验中,通过应用新方法和gap-PCR法,同步检测104例随机人群gDNA标本,分别检出缺失型α-地贫16例,经对比分析,两方法的检测结果相符,且均为本地区常见的缺失基因型,新方法的灵敏度与特异性均为100%。实验检测过程中,新方法的简单易行、高效率与高通量,并且检测结果准确可靠,由此初步说明了新方法进行大规模人群筛查的可行性与实用性。5.新方法能实现缺失型α-地贫的快速分子诊断,且有效解决了假阴性及假阳性等技术瓶颈。通过对545例大样本盲法分析,结果表明,新方法能准确诊断所有常见α-地贫缺失型,与gap-PCR的检测结果相符。并且：新方法检出了2例gap-PCR假阴性的少见缺失类型标本,并已用MLPA对比检测；检出了2例被——SEA污染的-α3.7/αα标本,此2例标本gap-PCR法检测为——SEA/—α3.7假阳性结果,也已通过MLPA及表型资料验证；同时,还检出一部分α1或α2基因多拷贝标本。此评价结果说明,所建立的新诊断方法,能实现缺失型α-地贫的快速分子诊断,其灵敏度与特异性均达到100%,有效解决了假阴性漏检及假阳性误诊。另外,本方法还能检出α珠蛋白基因CNVs,但其准确性与灵敏度还有待进一步改进。结论通过本研究,从理论上建立了一种“基于目的基因拷贝数直接定量”的缺失型α-地贫分子诊断新途径；从方法学研究上,建立了一种四重TaqMan实时定量荧光PCR缺失型α-地贫分子诊断新方法。这种新分子诊断途径与方法,是直接定量分析ξ、α1、α2珠蛋白基因相对拷贝数,而有效避免了由缺失类型遗传异质性导致的假阴性；采用TaqMan实时定量荧光PCR技术,能有效消除少量外源污染导致的假阳性,且易于实现自动化与标准化；另外,还可通过一个反应,同步完成基因缺失(拷贝数减少)和CNVs(拷贝数增加)分析,大大减少了工作量、检测成本及检测时间,提高了检测通量和检测效率。通过对灵敏度与准确性的全面评价,以及人群筛查的实用性初步评价,充分说明了本研究建立的分子诊断新方法准确可靠、简单实用、高通量低成本,适合缺失型α-地贫的大规模人群筛查和常规诊断。并且缺失型α-地贫是典型的基因缺失型遗传病,通过本研究所建立的分子诊断途径及诊断方法,具有普遍的代表性与通用性,可为其它基因缺失型遗传病的分子诊断方法学研究提供借鉴与参考。研究背景与目的人ξ珠蛋白是人体发育阶段构成胚胎血红蛋白的肽链分子,由位于16号染色体末端的ξ珠蛋白基因表达产生并参与胚胎期血红蛋白Hb GowerI(ζ2ε2)和Hb Portland Ⅰ(ζ2γ2)的合成,此后胚胎期第8周左右ξ珠蛋白基因表达关闭,由其他α珠蛋白链取而代之。研究发现,在人α珠蛋白基因簇发生大片段缺失时,ξ基因的表达会延迟,即在本该关闭的胎儿期至成人期会出现一定水平的ξ珠蛋白表达,这一独特现象目前在世界上仅见于三种地中海贫血缺失突变——东南亚缺失型α-地贫(——SEA/αα)、地中海缺失型α-地贫(——MED/αα)和西班牙缺失型α-地贫(——SPAN/αα)[2,3],由于种族差异,后两种地贫类型相对较少,且只发生于欧洲人群。东南亚缺失型α-地贫(——SEA/αα)是东南亚和我国南方地区最主要的地贫类型。后来,有报道用放射免疫法(RIA)检测溶血液中微量ξ珠蛋白筛查α-地贫SEA缺失类型；美国UBI MAGIWEL于2002年以ξ珠蛋白作为特异性遗传标志物建立了快速简便的a-地贫SEA缺失(——SEA/αα)酶联免疫(ELISA)检测法；本课题组也于2009年建立了SEA缺失型α[-地贫ξ珠蛋白链ELISA检测试剂盒。目前有关珠蛋白基因表达调控机制的研究已受到重视,影响珠蛋白表达量的分子基础可作为地贫基因治疗途径提供重要的参考依据。根据本课题组于ξ珠蛋白定性试剂盒研发过程中的研究数据发现,SEA携带者具有不同基因型的同一个体,如——SEA/αα、——SEA/—α和——SEA/αTα,以及同一基因型的不同个体,其ξ珠蛋白的表达量存在明显差异。探讨导致这种表达差异的具体分子机制,对深入了解珠蛋白基因表达调控有着重要的实际意义。据此,建立一种简单实用、准确可靠的ξ珠蛋白定量检测体系,是实现上述科研工作的前提条件。本研究的目的是以本课题组已研发的“东南亚缺失型(SEA)α-地贫ξ链ELISA检测试剂盒”为基本检测体系,制备定量检测的ξ珠蛋白标准品,以此确定定量检测有效浓度范围,建立ξ珠蛋白双抗体夹心ELISA定量检测体系,并对其专一性、抗干扰性、稳定性、准确性等进行全面评价。然后将其应用于本地区正常人群和a-地贫SEA缺失携带者的胎儿羊水、胎儿期和新生儿脐带血、成人外周血ξ珠蛋白定量检测,为下一步研究提供方法学支持并积累相关数据。研究方案与结果1.人天然ξ珠蛋白的分离纯化与鉴定以抗ξ珠蛋白单克隆抗体为配基,制备亲和层析柱,从Hb Bart’s水肿胎脐带血溶血液中分离天然ξ珠蛋白。分离的天然ξ珠蛋白经SDS-PAGE分析为含有16KD和32KD两种分子量的蛋白质混合物,Western Blot证实分别为ξ珠蛋白单体和ξ-γ珠蛋白二聚体。然后,采用分子筛层析从中分离纯化天然ξ珠蛋白单体,经SDS-PAGE、Western Blot和HPLC鉴定,其分子量为16KD且纯度>99.0%,经ELISA鉴定其抗原性可靠,保持了天然蛋白的生物活性,并与重组的ξ珠蛋白具有相同或相似的抗原表位。最后,采用参考方法确定分离纯化的天然ξ珠蛋白单体的蛋白浓度,作为定量检测的标准参考物。2.ξ珠蛋白双抗体夹心ELISA定量检测体系的建立以分离纯化的天然ξ珠蛋白单体标准参考物为基础,以本课题组已研发的东南亚缺失型(SEA)a-地贫ξ链ELISA检测试剂盒为检测体系,根据标准物浓度梯度的吸光度线性区域确定有效定量检测浓度范围为0.5-12μg/ml。然后,制备含天然ξ珠蛋白的Hb Bart’s水肿胎脐带血溶血液,以分离纯化的天然ξ珠蛋白单体标准参考物为标准,采用定量ELISA方法结合标本梯度稀释的方法对溶血液中ξ珠蛋白浓度进行定值,并以此定值后的溶血液作为常规定量检测体系标准品。3.ζ珠蛋白双抗体夹心ELISA定量检测体系的评价在已知浓度的纯化天然ζ珠蛋白单体标准参考物中加入干扰物,进行回收实验。常规检测标本中所含的无机盐成分、血浆蛋白和其它类型血红蛋白,以及浓度≤0.03%的叠氮钠防腐剂等物质不影响定量检测结果。对冷冻或冷藏保存的标准品进行反复冻融的贮存稳定性和检测重复性进行评价实验,结果显示ζ珠蛋白于4℃保存7天内抗原性无明显变化,-20℃非反复冻融可长时间保存,-20℃反复冻融3次以上则其抗原性大大降低。同时,通过对ζ-γ珠蛋白二聚体中ζ珠蛋白进行定量检测,结果显示二聚体不影响其定量检测结果。4.临床样本ζ珠蛋白双抗体夹心ELISA定量检测应用本研究建立的定量检测体系,对60例α-地贫正常基因型、——sEA/αα、 Hb Bart’s胎儿羊水ζ珠蛋白的定量检测结果显示,此三类基因型羊水标本中均未检出ζ珠蛋白链。85例包括正常及——sEA/αα胎儿脐带血ζ珠蛋白定量检测结果显示,这两种基因型的胎儿期均有ζ珠蛋白表达并随着孕周的增加而表达量下降,且——sEA/αα胎儿ζ珠蛋白量明显高于正常胎儿。71例不同年龄组正常人外周血ζ珠蛋白定量分析结果显示,正常人群出生后3个月时仍有少量ζ珠蛋白表达。278例——sEA/αα婴儿及成人外周血ζ珠蛋白定量分析结果显示,在——sEA/αα人群中,存在明显的ζ珠蛋白表达量差异,有近14%的——sEA/αα个体为ζ珠蛋白高表达。68例HbH病患者外周血ζ珠蛋白定量分析结果显示,HbH病患者的ζ珠蛋白表达量明显低于——sEA/αα。5.进一步的研究工作下一步的研究工作,将进一步完善定量检测体系,推广ζ珠蛋白检测在基础研究与临床中的应用。同时,根据ζ珠蛋白表达量在不同基因型、不同个体的差异现象,探讨其分子机制,进行基因调控等方面的进一步研究。结论本研究在东南亚型a-地中海贫血C链定性检测体系的基础上,通过亲和层析和分子筛层析分离纯化天然C珠蛋白单体作为标准参考物质,W C珠蛋白单体标准参考物质为基准而定值的含天然(珠蛋白的溶血液为常规检测标准品,成功建立了人C珠蛋白ELISA定量检测体系。此方法的浓度检测线性范围为0.5-12峭/ml,操作简单,结果稳定可靠,适用于羊水、巧带血和外周血中人ζ珠蛋白的定量检测。