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【研究背景】汉滩病毒(Hantaan virus,HTNV)属于布尼亚病毒目(Bunyavirales)汉坦病毒科(Hantaviridae),是我国重症肾综合征出血热(hemorrhagic fever with renal syndrome,HFRS)的主要病原体。HFRS死亡率为0.1%-15%,迄今尚无针对HTNV感染的特异性药物。以干扰素(interferon,IFN)为核心的固有免疫应答在机体抵御HTNV感染的过程中发挥重要作用,而RIG-I作为宿主细胞的模式识别受体(pathogen recognition receptor,PRR)能够识别病毒的病原体相关分子模式(pathogen-associated molecular pattern,PAMP),促进机体产生IFN。目前尚不清楚HTNV感染后宿主细胞中RIG-I信号通路的调控机制。近期研究表明长链非编码RNA(long noncoding RNA,lncRNA)可调控PRR等多种固有免疫相关基因的表达,与病毒感染增殖及其所致疾病的发生发展关系密切,但尚无文献报道HTNV感染后宿主lncRNA表达变化及其作用。【研究目的】本研究旨在通过数字基因表达谱(digital gene expression,DGE)分析HTNV-宿主细胞相互作用过程中宿主lncRNA的表达变化,从中筛选出具有抗病毒作用的分子并明确其抗HTNV感染的分子机制,为抗HTNV药物的研发提供理论基础。【方法与结果】1.NEAT1正向调控I型IFN信号通路活化进而抑制HTNV感染的作用确定1.1 NEAT1在HTNV感染后表达上调,且其表达与感染时间及感染剂量相关为研究HTNV感染后宿主细胞lncRNA表达变化,将HTNV以MOI=1感染人脐静脉血管内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs),同时设置Mock组(纯细胞组)、Co60-HTNV组(Co60灭活病毒处理组),24hpi提取RNA进行DGE分析,结果表明与Mock组或Co60-HTNV组相比,HTNV组中NEAT1、GAS5、IPW等多种lncRNA分子表达变化具有统计学意义,其中lncRNA NEAT1表达上调显著。荧光原位杂交(FISH)和实时定量PCR(qRT-PCR)等实验结果证实HTNV感染可在HUVECs、HEK293、A549、HeLa等多种细胞系中诱导NEAT1表达上调,且NEAT1表达上调趋势与感染时间、感染剂量在一定范围内呈正相关。1.2体外干预NEAT1-2表达可影响宿主细胞IFN产生及HTNV复制为明确NEAT1在汉坦病毒感染过程中的作用,在HUVECs中分别转染敲减NEAT1的siRNA或过表达NEAT1的质粒,转染24h后以MOI=0.1或1感染HTNV,48hpi进行相关实验。qRT-PCR、Western Blot及in-cell western等实验结果表明,敲减NEAT1-2可促进HTNV S片段复制及HTNV NP表达,而过表达NEAT1-2可抑制HTNV感染。qRT-PCR及ELISA等实验结果表明,敲减NEAT1-2可抑制HTNV感染后宿主细胞IFNβ、IL-8、CCL5的产生,而过表达NEAT1-2则促进HTNV感染后宿主细胞IFNβ、IL-8、CCL5的产生。NEAT1-2敲减条件下使用IFNβ处理细胞可抑制HTNV感染,而NEAT1-2过表达条件下使用IFNβ中和抗体可抑制HTNV感染。上述实验结果提示NEAT1-2可通过正向调控宿主细胞IFNβ产生进而抑制HTNV复制。1.3体内敲减NEAT1-2可在HTNV感染早期抑制机体IFN产生并加重HTNV感染为进一步研究NEAT1-2在体内对HTNV感染的影响,通过尾静脉注射siRNA的方式在C57BL/6J小鼠体内敲减NEAT1-2分子,之后感染HTNV,于3dpi进行ELISA、qRT-PCR、HE染色、流式细胞实验(FCM)等实验,结果表明,与NC+HTNV组相比,Si-NEAT1-2+HTNV组小鼠外周血IFNβ水平降低,肝、脾、肾等脏器中HTNV S片段及NP表达升高、病毒滴度增加,各脏器炎症细胞浸润减少但病理损伤加重,其中脾脏中CD11b+F4/80+Mφ、及CD8+IFNγ+T细胞数目减少。2.NEAT1-2与RIG-I信号通路交互作用调控I型IFN信号通路的分子机制研究2.1 HTNV感染通过RIG-I-IRF7信号通路诱导NEAT1-2表达上调上述实验利用细胞及动物感染模型明确了NEAT1-2抗HTNV感染的作用,但尚不清楚HTNV诱导NEAT1上调的分子机制。qRT-PCR实验结果表明,在HUVECs中过表达HTNV NP/Gn/Gc,或使用IFNα/β/γ、IL-1β、TNFα等不同细胞因子刺激HUVECs均不能诱导NEAT1-2上调;在HUVECs中敲减TLR3/4或MDA5亦不能阻遏HTNV感染后NEAT1-2表达,而在HUVECs中敲减RIG-I或IRF7,或在RIG-I敲除的细胞系Huh 7.5中,HTNV感染不能诱导NEAT1-2表达,上述实验结果提示HTNV主要通过RIG-I-IRF7信号通路诱导宿主细胞NEAT1-2表达。2.2 NEAT1-2正向调控HTNV感染后RIG-I及DDX60表达间接促进IFNβ表达为了明确NEAT1调控IFNβ表达的作用机制,在HUVECs中敲减NEAT1-2后感染HTNV,qRT-PCR及Western Blot实验结果表明NEAT1-2敲减后宿主细胞的RIG-I及DDX60分子显著下调。为明确RIG-I及DDX60分子在HTNV感染中的作用,在HUVECs中单独敲减RIG-I或DDX60,或共同敲减两者后感染HTNV,qRT-PCR、Western Blot等实验结果表明与NC对照组或单独敲减组相比,共同敲减组IFNβ产生减少,HTNV复制增加;在HUVECs中单独过表达RIG-I或DDX60,或共同过表达两者后感染HTNV,qRT-PCR、Western Blot等实验结果表明与Vector对照组或单独过表达组相比,共同过表达组IFNβ产生增加,HTNV复制减少。上述实验结果提示HTNV感染诱导NEAT1上调,NEAT1可促进RIG-I及DDX60表达,两者协同调控HTNV感染后宿主细胞IFNβ产生,抑制HTNV感染增殖。2.3 NEAT1-2通过募集SFPQ调控RIG-I及DDX60表达间接发挥抗HTNV作用既往生物信息预测结果表明脯氨酸及谷氨酰胺富集剪接因子(the splicing factor proline-glutamine rich,SFPQ)可能结合与RIG-I及DDX60启动子区域进而抑制其转录,而NEAT1-2结合SFPQ解除其转录抑制作用。为研究NEAT1-2调控RIG-I及DDX60表达的分子机制,通过RNA免疫共沉淀技术(RIP)检测HTNV感染前后NEAT1-2与蛋白SFPQ的结合变化,结果提示HTNV感染后NEAT1与SFPQ结合增加。通过Western Blot、免疫荧光技术(IFA)分别检测SFPQ在HTNV感染前后的蛋白表达量及亚细胞定位变化,结果表明SFPQ在HTNV感染前后表达量并无变化,而在感染前其弥散分布于核内,感染后在核内形成斑点。通过免疫共沉淀技术(Co-IP)检测SFPQ与核旁斑形成蛋白NONO在HTNV感染前后的结合情况,结果显示HTNV感染后SFPQ和NONO结合增加,上述结果提示HTNV感染后核旁斑形成增加。通过qRT-PCR等技术检测SFPQ敲减条件下HUVECs中RIG-I、DDX60分子表达变化及HTNV病毒复制情况,结果表明敲减SFPQ可促进RIG-I及DDX60表达,抑制HTNV感染后S片段复制。上述实验结果提示HTNV感染后NEAT1-2可募集SFPQ形成核旁斑,解除其对RIG-I及DDX60的转录抑制作用,间接发挥抗HTNV感染的功能。3.HFRS患者外周血单核细胞中NEAT1-2表达水平与疾病进展的相关性研究为明确NEAT1-2与HFRS疾病进展的关系,本研究利用阴性选择法分离HFRS患者外周血中的单核细胞(monocytes,Mo),通过qRT-PCR检测NEAT1-2的表达水平,分析其与疾病病程及病情严重程度的关系,结果表明与健康人或HFRS恢复期患者相比,HFRS发热期、低血压休克期及少尿期患者外周血Mo中的NEAT1-2水平明显升高。将外周血Mo中NEAT1-2表达水平与患者血清病毒载量、血肌酐(Scr)最高值、血小板数目(PLT)最低值及血白细胞数(WBC)进行回归分析,结果提示NEAT1-2表达水平与外周血病毒载量、Scr最高值呈负相关,与PLT最低值呈正相关,与WBC不存在回归关系。【实验结论】综上,HTNV感染通过RIG-I-IRF7信号通路诱导宿主细胞上调lncRNA NEAT1,而NEAT1通过募集SFPQ形成核旁斑,解除SFPQ对RIG-I、DDX60等分子的转录抑制作用,从而使RIG-I及DDX60协同促进HTNV感染后IFNβ产生,抑制HTNV感染复制。