心肌持续性缺血可导致组织损伤和细胞死亡,尽管早期再灌注对组织非常重要,但再灌注后血液循环中白细胞附壁、聚积、渗出血管而浸润心肌,导致心肌细胞坏死,加之补体激活以及活性氧的产生,致使缺血性心肌损伤更为严重,即缺血/再灌注损伤（MI/RI）。心脏直视手术时冠状动脉血运被阻断,心肌处于缺血乏氧状态;当手术结束心肌恢复正常血运时又导致心肌新的损伤——再灌注损伤。如何最大限度地减轻心肌MI/RI一直是心脏外科至关重要的课题。自1955年Melrose创用高钾停搏液以来,以高钾为主要成分的各种改良心肌保护液不断研制出来,明显改善了心肌保护的效果,提高了心脏手术的成功率。随着心脏外科技术的不断发展,先天性心脏病手术趋向幼龄化和复杂化。把适合于成熟心肌保护的停搏液直接应用于未成熟心肌保护是不合适的,缺乏理论和实验依据。近年来,未成熟心肌保护已成为心肌保护研究的热点之一。本研究采用幼兔离体缺血/再灌注心脏模型,通过检测冠脉流出液中CK-MB、LD₁/LD₂和ATP及心肌组织中MDA、SOD和GSH-PX的含量,心肌细胞中TNF蛋白、TNF mRNA和Bcl-2 mRNA表达的变化,以及心肌细胞凋亡情况,来探讨冷血浆停搏液对未成熟心肌的保护作用和机制,为冷血浆停搏液对未成熟心肌保护的临床研究提供实验依据和理论基础。实验材料1.实验动物与分组14～26日龄新西兰大耳白兔,体重350～580g,32只,雌雄不拘（清洁级,中国医科大学第二临床学院动物实验室提供）。随机抽取4只作为正常对照组,余28只随机均分为冷血浆（P）组和冷晶体（C）组。2.主要仪器上海产恒温水泵,德国产DIAX900匀浆机,德国产超声粉碎机,DUPONT SUPER T-21型离心机,JUNG-CM1800型切片机,PTC-100PCR扩增仪,KODAK ID型凝胶成像系统分析仪。3.主要试剂MDA、SOD和GSH-PX检测试剂盒由南京建成生物工程研究所提供;免疫组化试剂盒购自北京中山生物工程公司;原位杂交试剂盒购自武汉博士德生物工程有限公司;PCR检测试剂盒购自TaKaRa公司;引物由北京奥科生物工程公司提供。实验方法1.离体心脏制备与标本收集肌肉注射‘846’麻醉剂0.3ml/kg,耳缘静脉注入肝素400u/kg抗凝,正中开胸摘取心脏,立即侵入4℃的盐水中,主动脉插管,连接Langendorff灌注装置,用37℃的K-H液灌注,灌注压为60 cmH₂O（5.88kPa）,灌注10分钟后收集10分钟的冠脉流出液。正常对照组立即终止灌注,取右室心肌作检测用。P组和C组降温同时开始分别灌注冷血浆停搏液或冷晶体停搏液（4℃）20ml/kg,灌注压为60 cmH₂O（5.88kPa）。低温（10℃）停搏30分钟后,开始复温并再灌注37℃K-H液,10分钟后收集冠脉流出液,实验结束时取右室心肌作检测用。2.冷血浆停搏液的制备清洁级健康成熟新西兰大耳白兔,麻醉后解剖颈内动脉,穿入20号套管针放血,所收集血液经沉淀法分离血浆,与St.Thomas停搏液按4;1比例配成血浆停搏液,加钾至St.Thomas停搏液钾浓度后冷藏备用。3.检测指标及方法灌注停搏液至心脏机械停搏时间、心脏停搏前、后工作心的复跳时间、心率、冠脉流量、心肌含水量;用全自动生化检测仪检测冠脉流出液CK-MB和LD₁/LD₂含量;用高效液相色谱法检测冠脉流出液ATP含量;采用硫代巴比妥酸法、黄嘌呤氧化酶法和二硫代二硝基苯甲酸法分别检测心肌组织中MDA、SOD和GSH-PX;采用免疫组化、原位杂交、TUNEL法和RT-PCR方法分别检测心肌组织中TNF蛋白、TNF mRNA和Bcl-2 mRNA表达及细胞凋亡发生情况4.统计学方法所有数据均采用（?）±s表示,用SPSS 10.0统计软件进行t检验,P＜0.05有统计学意义。结果1.灌注冷血浆停搏液和冷晶体停搏液至心脏机械停搏时间分别为13.9±2.2秒和14.1±2.0秒,差异无显著性（P＞0.05）。2.P组复跳时间、心率、冠脉流量和心肌含水量分别为31.8±5.9秒、128.9±5.2 bpm、5.1±0.2 ml/min和72%±2%,C组为40.1±4.8秒、120.3±3.7 bpm、3.3±0.5 ml/min和77%±14%,差异显著（P＜0.05）。3.P组冠脉流出液中CK-MB、LD₁/LD₂和ATP含量分别为55.64±7.27 IU/L、0.86±0.04和0.94±0.17 umol/L,C组分别为88.93±3.27 IU/L、1.10±0.10和1.71±0.34 umol/L,差异显著（P＜0.01或P＜0.05）。4.P组心肌MDA和GSH-PX含量分别为0.18±0.03 nmol/mgprot和27.34±3.03 NU/mgprot,C组分别为0.27±0.05 nmol/mgprot和16.74±1.12 NU/mgprot,差异均非常显著（P＜0.01）;P组心肌SOD含量为114.15±12.57 NU/mgprot,C组为104.01±13.87 NU/mgprot,差异不显著（P＞0.05）。5.在无缺血/再灌注的未成熟心肌组织中没有TNF蛋白和TNF mRNA表达,染色呈阴性;但是,在经历缺血/再灌注的实验组,心肌组织中TNF蛋白和TNF mRNA表达明显,P组染色呈弱阳性或阳性,而C组呈强阳性或阳性。6.在元缺血/再灌注的对照组心肌组织中没有看到凋亡细胞;在经历缺血/再灌注的实验组,出现少量心肌细胞凋亡。7.缺血/再灌注损伤可以使心肌组织中Bcl-2 mRNA表达减弱;对照组心肌组织中Bcl-2 mRNA相对含量为0.921±0.015,P组为0.712±0.021,C组为0.504±0.028,差异显著（P＜0.01或P＜0.05）。讨论自1955年Melrose创用高钾停搏液以来,心肌保护研究已有四十余年历史。特别是在七十年代中期,以ST.Thomas液为主要代表的化学停搏液应用于临床,使心脏外科手术效果得到了明显改善。这些停搏液是在成年动物实验的基础上研制出来的,许多资料表明,停搏液对发育成熟的心脏可提供良好的心肌保护作用,但对发育中的婴幼儿心脏保护作用缺少深入的研究。在婴幼儿先天性心脏病减状或根治手术中,由于心肌保护不当导致左心功能不全是术后早期死亡的主要原因。近年研究发现未成熟心肌与成熟心肌在结构、功能及代谢等方面均存在着差异,采用相似的心肌保护方法是不合适的。1.冷血浆停搏液对幼兔心肌保护的可行性目前国内外学者对未成熟心肌保护的研究并不多,一些学者认为,单纯低温对未成熟心肌的保护可获得良好的效果;但相当一部分学者认为,为了减少心肌能量消耗,应使心肌快速停跳于舒张期。对未成熟心肌保护也应该用停搏液。良好的心脏停搏液能立即诱发心肌停搏于舒张期,减少能量需求、避免缺血性电、机械活动做功致能量耗竭;局部降温进一步减少能量需求并可预防电、机械活动再生;维持细胞酸碱平衡和膜的稳定性,创造低温代谢条件;提供能量,保持高渗透压,减轻心肌水肿。低温能降低心肌耗氧量;28℃时心肌耗氧量可减少39%,22℃时减少50%。冷血浆停搏液以血浆作为载体,加钾、降温构成一种新的心肌保护液,可提供丰富的代谢底物,具有较高胶体渗透压,酸硷缓冲能力大于晶体液,灌注中可减轻心肌细胞水肿,有清除氧自由基功能,使手术期间心肌处于低耗能、低损伤状态,有助于对心肌细胞形态及功能的维护。2.冷血浆停搏液对幼兔心肌酶和能量代谢的影响未成熟心肌高能磷酸化酶缺乏,高能磷酸盐含量高,糖原分解和无氧酵解能力强,更多地依赖葡萄糖或糖原的有氧分解和无氧酵解供给能量。未成熟心肌细胞中含有许多糖原颗粒,在应激情况下,无氧酵解能力较强,产生能量较多。另外,未成熟心肌收缩所消耗能量较少,耐受酸中毒能力较强。心肌缺血/再灌注损伤可出现细胞膜通透性与膜完整性的改变,再灌注后心肌酶的大量漏出即为这种改变的表现之一。急性心肌梗死时CK-MB阳性检出率达100%,特异性为92%～100%。正常情况下血清LDH酶谱排列为LD₂＞LD₁＞LD₃＞LD₄＞LD₅。心肌损伤时,主要释放LD₁,其次为LD₂,此时血清中LD₁将显著增加,并可在血清总LDH活力尚未发生改变时出现异常。因此,CK-MB和LD₁/LD₂是高灵敏度的诊断心肌缺血损伤的生化指标。心脏功能状态、心肌保护好坏与ATP水平密切相关,而能量的供需平衡又与氧的利用率不可分离。心肌缺血过程是一个缺氧、缺能量底物引起能量代谢改变的过程。由于未成熟心脏体积小、室壁薄、表面积/体积比值大,局部降温就能快速达到均匀低温状态,从而迅速降低心肌代谢并诱导心脏停搏而保护心肌,在未成熟心肌保护中,低温仍然是一个重要的保护措施。心肌细胞膜上的Na⁺/H⁺交换系统对于维持心肌细胞内pH值和细胞容积起重要的作用。但对缺血/再灌注损伤又起着介导作用。因此,它同时具有心肌细胞的保护与损害作用。冷血浆停搏液对未成熟心肌保护的机制是通过其提供丰富的能量底物,较强的酸碱缓冲能力,维持细胞内环境的稳定,对抗缺血/再灌注对未成熟心肌的损伤。3.冷血浆停搏液对氧自由基的影响MDA是脂质过氧化反应的终产物。因此,MDA不仅反映脂质过氧化程度,也间接反映OFR生成量和心肌细胞损伤程度。GSH-PX在细胞内能清除有害的过氧化物代谢产物,阻断脂质过氧化链锁反应。SOD是一种金属蛋白酶,是体内非常重要的OFR清除剂,它可以使缺血/再灌注后产生的OFR转变为H₂O₂,再与GSH-PX作用转变为H₂O。SOD是机体防御新陈代谢及其它生命活动中OFR损伤和破坏的抗氧化酶。GSH-PX在细胞浆中直接参与清除H₂O₂,易受OFR攻击而失活。缺血后产生的OFR大量消耗SOD和GSH-PX,使其含量下降,发生OFR损伤。SOD和GSH-PX具有清除超氧阴离子自由基,保护细胞膜结构和功能完整的作用。冷血浆停搏液可使离体缺血/再灌注幼兔心肌组织中MDA含量下降,SOD和GSH-PX含量增高,阻断脂质过氧化链锁反应,维持了细胞膜结构的完整性,实现其心肌保护的作用。其机制为冷血浆停搏液可促使K⁺通道开放,细胞膜超极化,从而抑制了Ca²⁺的内流,其结果减少了Ca²⁺对蛋白酶和磷脂酶的激活。SOD含量变化和冷晶体组相比较元统计学差异可能与未成熟心肌钙调节系统尚未完全成熟有关,还可能与实验心肌停搏的时间有关。4.冷血浆停搏液对缺血/再灌注介导的细胞凋亡的影响近年来的研究证明,缺血/再灌注损伤是一种肯定的、机制复杂的病理改变过程,其中包括氧自由基损伤、ATP酶水解、Ca²⁺超载和细胞凋亡等。1994年Gottlieb首先在兔心脏上发现再灌注损伤促进心肌细胞凋亡发生。在心肌缺血/再灌注损伤中,细胞死亡的形式除了坏死外,还有凋亡(主要发生在再灌注期间,发生机制与Ca²⁺超载有关),且凋亡是心肌缺血/再灌注损伤的重要组成部分。心肌组织内巨噬细胞,是TNF的主要来源,心肌细胞本身也产生TNF。局部心肌产生的TNF可能是影响心肌功能的一个重要因素。TNF作为一个促炎症的细胞因子,与细胞凋亡有着密切的关系,在心肌缺血/再灌注损伤中起重要作用。TNF可导致缺血后心肌功能不良,其主要机制是抑制心肌收缩功能（通过对心肌收缩力的直接影响）和诱导心肌细胞发生细胞凋亡。TNF可以激活鞘磷脂信号传导途径,导致细胞内具有信号传导作用的鞘氨醇产生。在心肌细胞中,由于鞘氨醇是一种非常有效的细胞凋亡介导因子,因此认为TNF触发细胞凋亡与TNF介导鞘氨醇产生有关。TNF也可以通过TNF受体1（TNF receptor 1,TNFR₁）引起心肌细胞凋亡。Bcl-2基因位于人18q21染色体位点上,其表达程度与抑制由于钙超载、氧自由基、兴奋性氨基酸等所致的细胞凋亡发生有关。其表达产物Bcl-2蛋白在细胞中主要定位于线粒体外膜、内质网膜和核周膜,可抑制细胞的死亡,有人认为它抑制的可能是细胞凋亡的共同下游通道。Bcl-2在各种正常细胞的激发和发育过程中表达,而在成熟的或走向凋亡的细胞中不表达或低表达。Bcl-2没有促进或增强细胞生长和增生作用。但大量研究表明它能延长细胞寿命,阻止或降低由射线、自由基、化学药物等引起的细胞凋亡,对氧化损伤造成的细胞凋亡具有肯定的抑制作用。TNF和Bcl-2是心肌缺血/再灌注损伤时发生细胞凋亡中重要影响因素。抑制和阻断TNF受体信号传导的瀑布式激活作用和增强Bcl-2基因表达是防止或减少心脏缺血后细胞凋亡的重要途径,在预防和减轻心肌缺血/再灌注损伤中具有重要的意义。本研究结果表明;在无缺血/再灌注的正常未成熟心肌组织中没有TNFmRNA和TNF蛋白表达,在经历缺血/再灌注的实验组心肌组织中TNFmRNA和TNF蛋白表达阳性,提示即使在无血液循环存在的情况下,缺血/再灌注也可以激发心肌细胞产生TNF。原位杂交和免疫组化的研究将TNF表达主要定位于心肌细胞,说明心肌细胞是影响心肌功能的TNF的重要来源。冷血浆停搏液可抑制TNF在心肌细胞内的表达,其机制可能是通过其抗氧化作用减少氧自由基的产生或抑制氧自由基活性,降低了氧自由基对P38促有丝分裂蛋白激酶（P38 mitogen-activated protein kinase,P38MAPK）和核因子Kappa B（Nuclear factorκB,NFκB）的激活作用,从而减少了心肌TNF的产生。TUNEL染色可以反映缺血后再灌注过程中细胞凋亡的发生几率。本研究中TUNEL染色阳性的凋亡细胞数比较少。一种可能是TUNEL阳性细胞百分率在离体模型比在体实验低许多;另一个可能是缺血/再灌注时间短的原因（本研究70分钟）。本研究中未延长再灌注时间,是因为在离体模型长时间的缺血和/或再灌注可以导致心脏发生心律失常和器官之间的更大变异。本研究的结果对缺血/再灌注未成熟心肌保护具有重要的临床指导意义。本研究采用的模型可以为在实验室对未成熟心肌保护机制进行研究和检验有效的预防和治疗方案提供一个便捷的途径。结论1.冷血浆停搏液具有使幼兔心脏快速停搏于舒张期的作用。2.与冷晶体停搏液相比冷血浆停搏液可明显提高幼兔心率及冠脉流量的恢复率,减轻心肌水肿。3.冷血浆停搏液可使幼兔缺血/再灌注心肌酶和ATP漏出减少。4.冷血浆停搏液可使幼兔缺血/再灌注心肌组织OFR生成减少,抗氧化能力增强。5.在缺血/再灌注过程中,冷血浆停搏液能抑制TNF蛋白和TNF mR-NA在心肌内的表达,上调Bcl-2 mRNA在心肌内的表达,从而抑制或延缓未成熟心肌细胞凋亡的发生。