研究背景:动脉粥样硬化(atherosderosis,AS)是一种复杂的多因素疾病,内皮细胞损伤、炎症机制在动脉粥样硬化的发生和发展中起着极为重要的作用。最近研究表明,非感染性甚至感染性因素引起的炎症反应和免疫系统的活化贯穿于AS的始终。但是,炎症因子及免疫反应与AS在分子机制上的关系尚不明了。因此,深入研究AS的炎症和免疫机制,探讨阻断AS的发病途径具有重要意义。免疫系统的基本功能是识别外源性抗原,诱导机体产生一系列免疫反应以清除外源性致病物质,保持机体的稳定。已知人类通过固有性免疫(先天性免疫)和适应性免疫(获得性免疫)两个免疫识别系统来抵御体内外各种有害物质。适应性免疫系统特异性识别环境中存在的独特抗原决定簇。固有性免疫是机体抵御各种微生物和有害物质的第一道屏障,识别被称为病原相关分子模式(PAMP)的高度保守抗原域。近年研究表明介导先天免疫和炎症反应的受体Toll样受体4(TLR4)参与了动脉粥样硬化的发生和发展。TLR4与特异性自身配体结合后,通过髓样分化因子88(MyD88)依赖性或非依赖性信号转导途径激活下游一系列蛋白级联反应,将刺激信号转导至细胞核内,导致核因子-κB、活化蛋白-1、干扰素调节因子等重要免疫基因转录因子的活化,从而诱导相应细胞因子如白细胞介素(IL-l、IL-2)、肿瘤坏死因子-a (TNF-a)及干扰素的合成与释放,并通过促进树突状细胞的成熟来启动获得性免疫反应,最终激发一系列针对不同病原微生物的免疫事件。目前对TLR4在AS中的作用机制的研究才刚刚开始,TLR4与MyD88依赖性或MyD88非依赖性信号转导通路在AS发生和发展中的机制尚不明确。因此,深入研究TLR4及MyD88依赖性或非依赖性信号转导通路在AS发生和发展中的作用及其相关机制,不仅为我们进一步研究AS的发病机制提供了一个新的角度,而且在治疗和预防AS方面也提出了新的思路。随着对AS研究的不断深入和越来越多炎症相关因子的相继发现,AS的炎症反应学说被普遍接受。在动脉粥样硬化的早期,白细胞、单核细胞和淋巴细胞等与血管内皮细胞的粘附、迁移是最重要的始动环节。单核细胞与血管内皮细胞粘附、跨内皮迁移、内膜巨噬细胞的聚集、平滑肌细胞的迁移和增殖以及细胞外基质的聚集等多个环节均依赖于粘附分子(如VCAM-1、ICAM-1等)的作用。研究表明细胞因子(TNF-a和IL-1β)增加单核细胞和冠状动脉平滑肌细胞的粘附是通过VCAM-1和ICAM-1的作用,证明TNF-a可引起VCAM-1和ICAM-1表达的升高。研究表明氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)作为致动脉粥样硬化的独立危险因素,主要通过其特异性受体-血凝素样氧化低密度脂蛋白受体1 (LOX-l)结合、摄取及降解并介导其生物学功能。已证实TLR4与LOX-1共同表达于动脉粥样硬化斑块内皮细胞中。研究表明LPS是TLR4的特异性配体,LPS可通过TLR4/ NF-KB信号转导途径上调LOX-1的表达,增加ox-LDL对内皮细胞的损伤,加速动脉粥样硬化的进程。因此,抑制LOX-1、TNF-a、ICAM-1的表达对动脉粥样硬化发生和发展有明显的抑制作用。治疗方面,已报道了多种具有抗AS作用的药物,大量研究表明他汀类药物存在多效性作用,成为当前最有效的治疗AS的药物之一。然而,他汀类药物抑制AS发生和发展的机理尚未完全阐明,另外,他汀类药物长期应用可产生明显不良反应,这在一定程度上限制了他汀类药物的临床应用。由于AS形成因素复杂,治疗AS的候选药物应能抑制AS的多个环节。而中药化学成分的多样性和生物活性的广泛性,为有效防治AS提供了理论上的可行性,其多环节、多靶点治疗AS且稳定性好,不良反应轻等特点,日益受到关注,有望使该病的治疗取得新的进展。近年来,多种中药已经被用于防治AS及其相关疾病,并显示出良好的作用,但中药与现代新型抗AS药物疗效的对比以及中药治疗AS的分子生物学机制研究尚不明确。深入研究中医药对TLR4及其下游信号转导通路的生物学特性及其调控机制的影响以及对LOX-1、TNF-a及ICAM-1表达的影响,从细胞和分子水平开展前瞻性的实验研究,有可能开发出靶点特异、高效的TLR4拮抗药物,可望为AS的中医药治疗及其机制研究提供新的切入点。目的:采用血清药理学方法研究益气活血复方对TLR4及其下游MyD88依赖性通路及非依赖性通路的影响及对LOX-1、TNF-a、ICAM-1表达的影响,探讨益气活血复方防治动脉粥样硬化的机制。方法:1、20只新西兰大耳白兔,随机分为空白组、中药高、中、低浓度组,每组5只,分别以生理盐水和高、中、低浓度益气活血复方灌胃,每日一次,连续7天。于末次灌胃给药2h后,心脏采血,离心后抽取上清液,合并同组含药血清,并用0.22μm一次性滤器无菌过滤,置-80℃冰箱中保存备用。2、取健康婴儿新鲜脐带,在无菌条件下,用胰酶消化法分离人脐静脉内皮细胞,在37℃、5% CO2条件下传代培养,并用第Ⅷ因子相关抗原进行鉴定。3、体外培养人脐静脉内皮细胞,随机分为6组,即正常组,模型组,西药对照组,中药高、中、低浓度组,用LPS(1μg/ml)刺激人脐静脉内皮细胞,激活TLR4及下游信号转导通路,并用不同浓度益气活血复方含药血清和阿托伐他汀进行干预,24h后收集细胞。用Real time PCR方法和Western blot方法分别检测TLR4、MyD88、TRAF-6、TRAM、TRIF及NF-KB mRNA和蛋白表达。4、用LPS(1μg/ml)刺激人脐静脉内皮细胞,激活LOX-1、TNF-a及ICAM-1,并用不同浓度益气活血复方含药血清和阿托伐他汀进行干预,24h后收集细胞。用Real time PCR方法和Western blot方法分别检测LOX-1、TNF-a及ICAM-1 mRNA和蛋白表达。结果:1、离心后获得的含药血清为淡黄色、澄清液体,每50ml血液大约可获得20-25ml血清。实验共获得4组血清,即空白对照组血清、益气活血高浓度组含药血清、益气活血中浓度组含药血清和益气活血低浓度组含药血清。2、培养到融合状态的细胞呈单层“铺路石”样排列,用第Ⅷ因子相关抗原免疫荧光染色发现,绝大多数细胞为第Ⅷ因子相关抗原阳性。3、经LPS刺激24h以后,模型组细胞TLR4及下游信号转导通路主要元件MyD88、TRAF-6及NF-κB mRNA和蛋白表达明显升高(与空白对照组比较P<0.01);经药物干预后各治疗组细胞TLR4、MyD88、TRAF-6及NF-κB mRNA和蛋白明显下降,其中西药对照组效果最为明显(与模型组比较P<0.01);3个中药组均对TLR4、MyD88、TRAF-6及NF-κB mRNA和蛋白表达有明显的抑制作用(与模型组比较P<0.01或P<0.05),其中中药高浓度组在3个浓度组当中效果最好。4、经LPS刺激24h以后,模型组细胞TLR4下游信号转导通路主要元件TRAM及TRIF mRNA表达明显升高(与空白对照组比较P<0.01);经药物干预后各治疗组细胞TRAM及TRIF mRNA表达无明显下降(与模型组比较P>0.05)。5、经LPS刺激24h以后,模型组细胞LOX-1、TNF-α及ICAM-1 mRNA和蛋白表达明显升高(与空白对照组比较P<0.01);经药物干预后各治疗组细胞LOX-1、TNF-α及ICAM-1 mRNA和蛋白表达明显下降,其中西药对照组效果最为明显(与模型组比较P<0.01);3个中药组均对LOX-1、TNF-α及ICAM-1 mRNA和蛋白表达有明显的抑制作用与模型组比较P<0.01或P<0.05),其中中药高浓度组在3个浓度组当中效果最好。结论:1、经上述方法可获得含不同浓度药物的含药血清,为下一步体外干预实验提供了原材料。2、采用胰蛋白酶消化法可从人脐静脉分离出内皮细胞,用人第Ⅷ因子相关抗原免疫组化法检测,证明所获得的是内皮细胞。3、LPS可激活TLR4及其下游MyD88依赖性信号转导通路主要元件MyD88、TRAF-6和NF-KB mRNA和蛋白表达,干预24h后益气活血复方可抑制TLR4、MyD88、TRAF-6和NF-KB mRNA和蛋白表达,说明益气活血复方可抑制TLR4及其下游MyD88依赖性信号转导通路主要元件mRNA和蛋白的表达。4、LPS可激活TLR4下游MyD88非依赖性信号转导通路主要元件TRAM和TRIF mRNA表达,干预24h后益气活血复方对TRAM和TRIF mRNA表达无明显的抑制作用,说明益气活血复方对MyD88非依赖性信号转导通路没有抑制作用。5、LPS可激活LOX-1、TNF-α及ICAM-1 mRNA和蛋白的表达,干预24h后益气活血复方可抑制LOX-1、TNF-α及ICAM-1 mRNA和蛋白的表达,说明益气活血复方对LOX-1、TNF-α及ICAM-1有抑制作用,这可能是其防治动脉粥样硬化的机制之一。