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糖尿病是一种慢性内分泌代谢疾病，是由环境与遗传两大因素相互作用进而引起的全身性临床综合症疾病。人体中缺乏胰岛素致使胰岛素不能有效发挥作用，致使体内缺乏绝对或相对胰岛素，从而造成血液中的葡萄糖不能以正常途径进入细胞胞内进行分解和代谢，或者当靶组织细胞对胰岛素敏感性降低，都是诱发糖尿病发病的主要原因。由于胰岛素疗效明确，且主要用于维持人体内的正常血糖值，所以胰岛素对治疗糖尿病尤为重要。胰岛素类药物上市八十年以来，各国科研人员将基因工程技术与胰岛素的基础结构研究相结合，构建出一系列的胰岛素类似物，并希望从中得到最合理有效且成本最低的制备工艺，从而使这一挽救生命的药物能够被更多的贫困国家承担和接受。 研究目的:本项目设计重组赖氨酸肽链内肽酶（以下简称Lys-C）蛋白氨基酸序列，根据P.Pastoris酵母密码子偏爱性原则设计cDNA序列，其中TGA和TAA为两个终止密码子序列，并在序列5′端和3′端分别设计XhoI（CTCGAG）和NotI（GCGGCCGC）限制性酶切位点,将其重组到真核表达质粒中，并在毕赤酵母中获得表达，筛选并得到具有高效分泌表达的且具有酶切活性的重组赖氨酸内肽酶毕赤酵母工程菌。SDS-PAGE电泳法及免疫斑点法检测其蛋白表达，RP-HPLC法分析重组赖氨酸内肽酶可以特异性切除赖氨酸基团C末端的氨基酸残基，证明实验设计的重组的赖氨酸内肽酶可以在大规模的生产胰岛素的制备工艺中替代Wako公司的Lysyl-Endopeptidase。 研究方法: ①重组Lys-C的构建与表达1)Lys-C/pPIC9K：本试验最终设计的目的载体为pPIC9K，但是在pPIC9K上的有两个相距较远的酶切位点XhoI，不利于双酶切和酶切鉴定，所以先构建重组质粒Lys-C/pPIC9。将Lys-C插入到载体质粒pPIC9中，酶切鉴定正确后，再将Lys-C克隆到pPIC9K上的SalI和SacI之间，构建重组质粒Lys-C/pPIC9K；Lys-C/pPICZalphaA：在载体pPICZalphaA上，有酶切位点XhoI和NotI，将Lys-C插入到pPICZalphaA中，可以构建重组质粒Lys-C/pPICZalphaA。2)线性化Lys-C/pPIC9K和Lys-C/pPICZalphaA并电转化毕赤酵母菌株GS115、X-33。3)利用含不同浓度G418或Zeocin的平板筛选获得多拷贝重组工程菌Lys-C/pPIC9K/GS115或Lys-C/pPICZalphaA/X-33。4)毕赤酵母摇瓶筛选高表达有活性的重组Lys-C菌株。 ②重组Lys-C对胰岛素原的酶切按照胰岛素原与重组Lys-C质量比1：10000，37℃酶切过夜。 ③重组Lys-C的蛋白表达鉴定用15％ TricineSDS-PAGE电泳法和免疫斑点法以及RP-HPLC法检测是否有蛋白表达。 ④重组Lys-C的酶切活性测定用重组后的赖氨酸内肽酶酶切胰岛素原，并与Wako公司的Lys-C做对比试验，RP-HPLC法分析酶切活性，从而得出结果判断重组是否可以替代天然提取的Lys-C应用于胰岛素的大规模生产工艺中。 研究结果:用15% SDS-PAGE凝胶电泳、免疫斑点法和RP-HPLC法检测重组子有表达，并且保留时间基本相同，可以判断出两者具有相似的蛋白序列。RP-HPLC法分析重组赖氨酸内肽酶可以特异性切除赖氨酸基团C末端的氨基酸残基，说明重组赖氨酸内肽酶酶切活性很高。15% SDS-PAGE凝胶电泳证明了重组赖氨酸内肽酶在毕赤酵母中的高效分泌表达且分子量与理论分子量相符，新建立了重组赖氨酸内肽酶单一蛋白酶切除引导肽与短C肽的条件，对于大规模的生产人胰岛素类似物的研究以及工艺生产具有重要意义。