印楝叶及其活性物质的杀蝗活性研究

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印楝(Azadirachta indica A. Juss)是印度传统药用植物,具有抗寄生虫,抗氧化,抗癌,抗细菌,抗病毒,抗真菌,抗溃疡,杀精,抗着床,抗糖尿病,调节免疫,杀软体动物和杀虫等生物活性。近年来关于印楝提取物杀虫方面的研究较多,但对中华稻蝗(Oxya chinensis)的杀虫活性研究较少。为开发新型植物杀虫剂,本文研究了印楝叶及其活性物质对中华稻蝗5龄幼虫的杀虫活性。在此基础上,采取生物活性追踪结合化学分离的方法对印楝叶杀蝗活性物质进行了分离及成分分析,同时研究了印楝叶提取物对中华稻蝗5龄幼虫的主要作用方式及作用机理。主要研究结果如下:1.印楝叶不同溶剂提取物的杀蝗活性研究:采用石油醚、95%乙醇和水3种不同极性溶剂对印楝叶进行提取,以中华稻蝗5龄幼虫作为试虫,采用浸虫浸叶法测定印楝叶不同溶剂提取物的杀虫活性。结果表明:3种不同溶剂提取物的得率分别为2.20%、25.95%和46.80%,对中华稻蝗5龄幼虫具有较强杀虫活性的是印楝叶石油醚提取物,其次是95%乙醇提取物,水提取物未表现出明显的杀虫活性。石油醚提取物与95%乙醇提取物在25mg/mL浓度条件下,对试虫的杀虫活性差异不大,处理72h后试虫的死亡率分别为33.33%和26.67%,但两者的提取得率差异显著,所以选择95%乙醇提取物做进一步研究。2.印楝叶95%乙醇提取物杀蝗活性部位的筛选:采用液-液萃取法对印楝叶95%乙醇提取物进行初步分离,并采用浸虫浸叶法对各萃取物进行杀虫活性测定,选择杀虫活性最强的萃取物做进一步研究。结果表明:印楝叶95%乙醇提取物的石油醚萃取物、氯仿萃取物、乙酸乙酯萃取物、正丁醇萃取物和水部分的得率分别为13.88%、7.33%、4.22%、20.80%和48.34%。浓度为25mg/mL时,在该浓度条件下的所有测试时间段里,乙酸乙酯萃取物、正丁醇萃取物和水部分均未表现出明显的杀虫活性。石油醚萃取物和氯仿萃取物表现出不同程度的杀虫活性,处理24h后,试虫的死亡率均为23.33%,处理48h后,试虫的死亡率分别为73.33%和30.00%,处理72h后,试虫的死亡率分别为80.00%和43.33%。由此可见石油醚萃取物具有最高的杀虫活性,因而对其进行毒力测定,结果显示其48h和72h的半数致死浓度(Median lethal concentration, LC50)分别为20.0667mg/mL和14.9262mg/mL。3.印楝叶95%乙醇提取物的石油醚萃取物中杀蝗活性物质的柱层析分离:采用硅胶柱层析(洗脱剂为正己烷:乙酸乙酯:丙酮(8.5:1:0.5))对印楝叶95%乙醇提取物的石油醚萃取物进行进一步的分离,分3段收集,采用浸虫浸叶法测定柱层析各段物质的杀蝗活性,并使用气相色谱-质谱联用技术(Gas chromatography-mass spectroscopy, GC-MS)对杀蝗活性最强的柱层析段进行成分分析。结果表明:柱层析第Ⅰ段物质具有最强的杀蝗活性,第Ⅱ段和第Ⅲ段物质的杀蝗活性较弱,且这两段物质的杀蝗活性差异不显著。以上三段物质24h的LC5o分别为14.3563mg/mL、24.5616mg/mL和23.7878mg/mL。GC-MS对柱层析第Ⅰ段物质成分分析的结果显示其主要由棕榈酸乙酯、(Z,Z,Z)-9,12,15-十八碳三烯酸乙酯、二十五烷、二十六烷、二十七烷、二十九烷、三十烷、三十一烷、角鲨烯和芥酸酰胺组成。4.印楝叶95%乙醇提取物的石油醚萃取物杀蝗作用方式及作用机理研究:通过测定印楝叶95%乙醇提取物的石油醚萃取物对中华稻蝗5龄幼虫的拒食、触杀、胃毒和生长发育抑制活性初步研究其杀虫作用方式,并采用浸虫浸叶法处理试虫,于处理后24h、48h和72h取出试虫中肠,制作石蜡切片,在光学显微镜和透射电镜下观察试虫中肠的病理学变化来初步研究印楝叶95%乙醇提取物的石油醚萃取物的杀虫作用机理。结果表明:印楝叶95%乙醇提取物的石油醚萃取物对中华稻蝗5龄幼虫的主要作用方式为拒食。光镜下,蝗虫中肠细胞肿胀,变性,继而局部脱落,严重者中肠细胞全部脱落,消融而仅剩下环肌层;电镜下,蝗虫中肠柱状细胞结构受到严重损伤:顶膜微绒毛断裂,脱落;线粒体肿胀,内嵴紊乱,并出现髓鞘样构形;粗面内质网扩张,核糖体脱落,断裂和囊泡化。病理学变化结果表明,破坏试虫中肠组织正常结构和引起其中肠细胞内膜结构损伤可能是印楝叶95%乙醇提取物的石油醚萃取物的主要作用机理之一。
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