【摘 要】
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甘薯为世界第七大粮食作物,因其具有低成本、高收益、生物产量高等被我国大范围种植。我国作为世界上最大甘薯生产国,由于种植地区不同,环境不同,大多生长在较为贫瘠的土壤中,对甘薯的产量有着很大的影响,因此当前对甘薯抗逆相关的研究迫在眉睫。抗坏血酸(As A)是植物中含量丰富的一种重要的抗氧化剂,是清除活性氧(ROS)的主要贡献者,当植物遭受干旱、盐渍、高温、低温等逆境胁迫时会产生ROS,进而导致氧化损伤
【基金项目】
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山西省基础研究计划项目(201801D121204); 山西农业大学国家自然科学基金培育项目(2017GPY06); 山西农业大学科技创新基金项目(2018yz003);
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甘薯为世界第七大粮食作物,因其具有低成本、高收益、生物产量高等被我国大范围种植。我国作为世界上最大甘薯生产国,由于种植地区不同,环境不同,大多生长在较为贫瘠的土壤中,对甘薯的产量有着很大的影响,因此当前对甘薯抗逆相关的研究迫在眉睫。抗坏血酸(As A)是植物中含量丰富的一种重要的抗氧化剂,是清除活性氧(ROS)的主要贡献者,当植物遭受干旱、盐渍、高温、低温等逆境胁迫时会产生ROS,进而导致氧化损伤,此时,As A可参与ROS的酶促及非酶促的清除过程,进而增强植物的抗逆性。脱氢抗坏血酸还原酶(DHAR)在As A再生过程中起着重要的作用,并且可以广泛参与植物对生物及非生物胁迫的抵御,进而提高植物的抗逆性。本研究基于甘薯转录组数据库,通过RT-PCR技术,从徐薯18叶片中成功克隆获得IbDHAR3基因全长,分别对其进行序列以及表达模式分析,构建植物表达载体进行亚细胞定位,IbDHAR3基因转拟南芥,并对转基因拟南芥T3代进行抗逆功能鉴定,IbDHAR3基因转化甘薯,并对转基因甘薯的抗逆功能鉴定及作用机理进行研究。结果如下:(1)成功克隆获得IbDHAR3基因,其序列全长为813 bp,编码270个氨基酸。IbDHAR3基因的编码蛋白包含52个氨基酸的叶绿体转运肽,以及谷胱甘肽-S-转移酶(GST)N-端和GST-C-DHAR两个结构域,不含信号肽,预测其二级结构以α-螺旋为主,有β-折叠,预测其三级结构是一个单体蛋白。对其亚细胞定位预测,IbDHAR3最可能定位于叶绿体中,是一个亲水性蛋白;(2)通过qRT-PCR进行IbDHAR3基因在不同组织及不同非生物胁迫条件下的相对表达模式分析。结果表明,其在各组织均有不同程度的表达,但在叶片中的相对表达量最高;ABA、干旱、盐渍、高温处理条件下均可诱导IbDHAR3基因上调表达;采用Gateway技术成功构建表达载体IbDHAR3-p GWB5,将其转化农杆菌并进行烟草叶片瞬时表达,共聚焦结果显示IbDHAR3蛋白亚细胞定位于叶绿体;(3)用蘸花法转化拟南芥,结合抗生素成功筛选出6个IbDHAR3转基因T3代拟南芥株系,选取IbDHAR3转基因拟南芥株系(OE5,OE13)做抗逆功能鉴定研究。高盐和渗透胁迫条件下,拟南芥转基因株系的种子萌发率、根长和鲜重均高于野生型(WT);干旱和高盐胁迫条件下,NBT和DAB染色试验表明拟南芥转基因株系叶片染色颜色均比野生型浅,O2·-和H2O2含量均低于野生型;干旱胁迫时,IbDHAR3基因表达上调,提高了转基因株系At GR基因的相对表达水平,WT中MDA、As A含量显著高于过表达系,拟南芥过表达系DHAR、抗坏血酸过氧化物酶(APX)、超氧化物歧化酶(SOD)活性显著高于WT。证明IbDHAR3在转基因拟南芥中过表达提高了拟南芥的抗逆性,为进一步探究转IbDHAR3基因甘薯的抗逆功能鉴定奠定理论基础;(4)采用农杆菌介导法进行甘薯遗传转化,成功获得10个IbDHAR3转基因甘薯株系;并分别选择相对表达水平较高的两个转基因株系(SD6,SD10)进行抗逆功能鉴定。叶盘法胁迫试验结果表明:在高盐、渗透胁迫条件下,转基因株系叶盘叶绿素含量均不同程度高于野生型;氧化胁迫条件下,转基因株系的相对质膜透性均比野生型的增加量低,DAB与NBT染色后野生型的叶盘均比转基因株系的颜色更深,表明野生型的叶盘均比转基因株系氧化损伤更严重。甘薯盆栽试验结果表明:高盐、干旱胁迫条件下转基因甘薯株系Fv/Fm高于野生型,而野生型的H2O2和MDA含量均高于转基因株系;转基因甘薯株系的APX、SOD、过氧化物酶(POD)、过氧化氢酶(CAT)等含量均高于野生型;转基因株系的DHAR含量均高于野生型,且转基因株系的As A/DHA(脱氢抗坏血酸)的比值均高于野生型。以上结果证明了IbDHAR3基因在转基因甘薯中过表达通过促进抗坏血酸-谷胱甘肽循环和相关抗氧化酶系统的机制,增强对H2O2等活性氧的清除能力,进而提高了甘薯的抗逆能力。综上所述,明确了IbDHAR3基因在甘薯逆境应答反应中的分子机制,为深入解析该基因的功能及在甘薯分子遗传改良上的应用奠定基础。
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