枯草芽孢杆菌(B.subtilis)具有维持肠道微生态平衡、促进机体健康的功能,其饲喂效果受肠道环境影响较大,而抗生素的长期使用会影响肠道微生态平衡,而两者联用可能发挥协同作用。现阶段枯草芽孢杆菌的添加主要集中于产蛋期,开产前的营养常常被忽略,因此本试验将枯草芽孢杆菌与非治疗剂量的杆菌肽锌(Zinc Bacitracin,ZB)联用并根据蛋鸡开产前(0~16周龄)生理特点所分的四个阶段(0~3、4~6、7~12和13~16周龄)进行混合阶段性添加,探索其对蛋鸡生长发育和肠道健康的影响以及是否能通过两者联用改善单独使用抗生素造成的肠道微生态失调,以期通过短期的联用达到持续性的作用从而替代长期使用抗生素,为枯草芽孢杆菌在蛋鸡生产中的应用方式和添加阶段提供理论依据。试验包括三部分:试验一B.subtilis和ZB阶段性添加对0~16周龄蛋鸡生长性能的影响本试验将630只1日龄海兰褐雏鸡随机分为5个处理,每处理7个重复,每重复18只鸡,试验期16周。试验共分为五个处理:1)AGP组:0~16周龄均饲喂基础日粮+杆菌肽锌(Zinc Bacitracin,20 mg/kg,下同);2)BA3组:0~3周龄饲喂基础日粮+Zinc Bacitracin+B.subtilis(500 mg/kg,下同),4~16周龄饲喂基础日粮;3)BA6组:0~6周龄饲喂基础日粮+Zinc Bacitracin+B.subtilis,7~16周龄饲喂基础日粮;4)BA12组:0~12周龄饲喂基础日粮+Zinc Bacitracin+B.subtilis,13~16周龄饲喂基础日粮;5)BA16组:0~16周龄饲喂基础日粮+Zinc Bacitracin+B.subtilis。结果显示:1)枯草芽孢杆菌和杆菌肽锌在各阶段的混合添加对0~16周龄蛋鸡平均体重、平均日采食量、平均日增重和料重比均无显著影响(P>0.05);2)各处理对3、6周龄免疫和消化器官指数、十二指肠淀粉酶、脂肪酶活性无显著影响(P>0.05),对12周龄胫骨和龙骨长度无显著影响(P>0.05),但各组的胫骨长度基本达到标准,对16周龄脂肪沉积也无显著影响。本试验结果表明:0~3周龄的阶段性联用可使12周龄青年蛋鸡体尺和开产前体重达标,对0~16周龄蛋鸡的生长发育有持续性效果。试验二B.subtilis和ZB阶段性添加对0~16周龄蛋鸡肠道健康的影响本试验分别于3、6、12、16周龄采集蛋鸡十二指肠、空肠和回肠肠道黏膜和肠段样品。肠段用来制作石蜡切片观察肠道形态,黏膜样品通过RT-qPCR技术测定肠道二糖酶、紧密连接蛋白(ZO-1和Occludin)、黏蛋白(Mucin2)的mRNA表达水平,通过ELISA法检测黏膜sIgA的含量。结果显示:1)BA3组显著降低了3周龄十二指肠和空肠隐窝深度(P<0.05),且十二指肠绒毛高度/隐窝深度比值有升高的趋势(P=0.058),但显著降低了空肠和回肠绒毛高度(P<0.05),而12周龄时,BA3组空肠绒毛高度显著高于AGP组和BA6组(P<0.05),而各阶段添加组相比于AGP组回肠绒毛高度和绒毛高度/隐窝深度比值均显著升高(P<0.05),且回肠隐窝深度显著降低(P<0.05),16周龄时,BA16组的绒毛高度显著高于AGP组和BA6组(P<0.05),而与BA3和BA12组无显著差异(P>0.05);2)BA3组蛋鸡6周龄的十二指肠和回肠蔗糖酶基因表达相比于BA6组显著上调(P<0.05),而12周龄空肠蔗糖酶基因表达相比于AGP和BA6组显著上调(P<0.05);3)各组对0~16周龄蛋鸡小肠ZO-1、Occludin、Mucin2 mRNA水平无显著影响(P>0.05);4)BA3组显著提高了16周龄空肠黏膜sIgA含量(P<0.05),其余组间均无显著差异(P>0.05)。本试验结果表明,0~3周龄的阶段性联用改善7~12周龄小肠形态和蔗糖酶基因的表达以及13~16周龄黏膜免疫功能,从而维持蛋鸡全期的生长发育。试验三B.subtilis和ZB阶段性添加对0~16周龄蛋鸡盲肠微生物的影响本试验分别于3、6、12、16周龄采集蛋鸡盲肠内容物样品,针对16s rDNA V4区进行高通量测序,检测盲肠菌群结构和群落演替规律,同时筛选出四种菌进行绝对定量。结果显示:1)3周龄时,BA3组优势菌门为厚壁菌门(91.6%)和柔膜菌门(5.7%),AGP组优势菌门为厚壁菌门(81.9%)、拟杆菌门(10.0%)和柔膜菌门(5.3%),而到6周龄时,BA3组优势菌门仍为厚壁菌门(85.8%)和柔膜菌门(9.9%),拟杆菌门比例仅占2.6%,而AGP组和BA6组优势菌门均为厚壁菌门(67.1~68.1%)、拟杆菌门(26.7~28.8%)和柔膜菌门(2.2~2.3%),但到7~16周龄,菌群结构趋于稳定,优势菌门稳定为厚壁菌门和拟杆菌门;2)3周龄时,BA3组Anaerotruncus属相对丰度均显著低于AGP组(P<0.05);6周龄时BA3组Alistipes、Bacteroides、Odoribacter、Dehalobacterium等属的相对丰度最低(P<0.05),而Lactobacillus、Dorea、Oscillospira、Ruminococcus、Anaeroplasma等属的相对丰度均最高(P<0.05),而Sutterella相对丰度显著低于BA6组(P<0.05),但与AGP组无显著差异(P>0.05);12周龄时,BA12组厚壁菌门[Ruminococcus]的相对丰度显著高于ZB组和BA6组(P<0.05),而BA6组Oscillospira的相对丰度显著低于其他组(P<0.05),Bilophila的相对丰度显著高于其他组(P<0.05);16周龄时,大部分菌群结构趋于稳定,该阶段仅BA3组变形菌门的Sutterella相对丰度显著高于其他组(P<0.05),各处理对其余菌属均无显著影响(P>0.05);3)PCoA分析结果显示,蛋鸡0~16周龄盲肠微生物的发育和演替也具有阶段性,且混合添加比单独添加杆菌肽锌具有明显的调控和改善作用;4)6周龄时,BA6组盲肠大肠杆菌的数量显著低于BA3组(P<0.05),但与杆菌肽锌组无显著差异(P>0.05);12周龄时,各阶段混合添加组盲肠脆弱拟杆菌的数量均显著升高(P<0.05),而BA3和BA6组盲肠柔嫩梭菌的数量均显著高于杆菌肽锌组(P<0.05),但盲肠大肠杆菌和沙门氏菌数量无明显变化(P>0.05);16周龄时,短期和长期的混合添加对盲肠脆弱拟杆菌、柔嫩梭菌、大肠杆菌和肠炎沙门氏菌的数量均无显著影响(P>0.05)。本试验结果表明,枯草芽孢杆菌和杆菌肽锌在0~3周龄短期的阶段性联用能够通过改善0~6周龄微生物结构和维持后期微生态平衡,进而改善肠道健康,维持蛋鸡各阶段器官系统的发育和全期的生长发育,从而在不影响蛋鸡生长发育基础上减少了杆菌肽锌的使用周期,部分替代杆菌肽锌的使用。综上所述,杆菌肽锌的添加通过减少总菌的数量对机体发挥促生长作用,且可能引起肠道微生物失调和炎症的发生。而0~3周混合添加枯草芽孢杆菌和杆菌肽锌在前期主要调节肠道微生物区系的平衡,尤其在6周龄,促进Lactobacillus、Oscillospira和Ruminococcus等有益厌氧菌的生长,虽然延缓了拟杆菌门的发育,但改善了肠道炎症相关菌群,从而维持了肠道健康,保证各阶段器官和系统的正常发育。由于肠道微生物发育和成熟的阶段性,早期的联用在微生物建立和发育的阶段发挥了重要作用并能够持续影响后期,因而在7~12周龄微生物已趋于稳定的阶段,主要发挥了促进肠道健康、改善小肠消化吸收和黏膜免疫功能的作用,使得机体在全期均能维持正常的生长发育,从而达到开产前的标准。