E.coli赖氨酰-tRNA合成酶(LysU):结构与功能研究

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Ap4A是一类广泛存在于生物体内的5’,5"’-四磷酸连接的二腺苷化合物,在调节细胞凋亡、增殖和分化,DNA复制和损伤,应答热击逆境等多种生命活动中扮演“信号分子”的角色。E.coli热击诱导赖氨酰-tRNA合成酶(LysU)具有高效的Ap4A合成率(~80%)。LysU催化Ap4A合成可分为2步:首先,催化赖氨酸与ATP的α-磷酸形成赖氨酰-腺苷中间物,同时释放无机焦磷酸;接着第二个ATP的γ-磷酸进攻赖氨酰-腺苷中间物,生成Ap4A和赖氨酸。研究者发现低浓度Zn2+能促进LysU生成Ap4A,但对Zn2+促进Ap4A合成的分子机理及LysU中是否存在锌离子结合位点却一无所知。在本研究中,首先我们用计算机分子动力学模拟方法分析了LysU催化位点氨基酸残基与底物结合状态,提出潜在的锌离子结合位点。接着,采用蛋白质定点突变技术设计不同性质的氨基酸突变结合位点,经lysU基因缺陷型菌株E.coli lysU2-17A诱导表达和三步纯化法获得高纯度的突变体蛋白,对其空间结构通过圆二色光谱和内源性荧光光谱扫描加以验证。我们利用自主构建的多磷酸腺苷产物检测系统,检测了突变体与野生型LysU的Ap4A合成活性和对Zn2+的敏感度。最后,我们用蛋白模拟方法计算结合位点与ATP底物间的氢键距离和结合自由能。研究结果表明,LysU与底物结合时,赖氨酸结合部位无明显变化,而赖氨酰-腺苷中间物形成后,模体2环结构中的ATP结合部位(Arg269)发生了较大移动,形成“盖子”结构。同时Mg2+(2)脱离活性结合位点,导致Glu264和赖氨酰-腺苷中间物的腺嘌呤环N7之间形成空的负电口袋,从而为Zn2+提供了合适的结合位点。由此,我们推测Glu264可能是LysU合成Ap4A反应中锌离子结合的理想位点。我们通过点突变破坏氨基酸残基与锌离子的结合,使其Ap4A生成速度下降。因此,我们构建了6个Glu264、4个Arg269和16个模体2环结构的丙氨酸扫描突变蛋白,囊括了活性位点的主要氨基酸残基。圆二色光谱扫描和盐酸胍诱导的内源性荧光光谱表明所有蛋白具有相似的二级结构百分比(37%α-螺旋、26%β-折叠和37%无规则卷曲)和变性中点(Cm),证明所有蛋白维持原有三级构象,突变未对活性位点空间结构造成大的变化。因此,突变体与野生型LysU催化性质上的差异可理解为对应氨基酸位点在蛋白结构与功能中的作用。突变体Zn2+敏感性实验和蛋白模拟计算证明了我们的推测:LysU催化赖氨酰一腺苷中间物合成后,Arg269发生移动,“打开”催化口袋,Mg2+(2)脱离结合位点,Glu264与赖氨酰一腺苷中间物形成负电口袋方便Zn2+进入,接着第2个ATP以N7-N7’桥接方式结合锌离子,形成"N7-Zn(Glu264)-N7"中间态,同时ATP的γ-磷酸进攻赖氨酰一腺苷中间物的α-磷酸,快速形成Ap4A产物。此外,我们意外地发现LysU除氨酰化tRNALys和合成Ap4A之外的催化活性。LysU具有甘油激酶活性,无需Zn2+和赖氨酸便能催化ATP和甘油生成ADP和(L)-甘油-3-磷酸。该活性与Zn2+诱导的Ap4A/Ap3A合成反应互补,能减弱或遏制LysU的Ap4A催化功能,表现为甘油阻遏效应。LysU还具有过氧化氢中和活性,能分解H202生成水并释放氧气。综上所述,现阶段探讨锌离子与LysU相互作用的同类工作还很少,基于蛋白质结构水平分析其催化机理的研究更是缺乏。本研究结合计算机模拟和蛋白实验技术,逐步探讨锌离子与LysU相互作用过程。整个实验设计新颖,创新点明显,对进一步探讨Zn2+调节的Ap4A合成在生物体内的意义提供重要理论基础。同时,我们首次报道了LysU的甘油激酶活性和过氧化氢中和活性,开启了LysU多功能催化活性研究的新领域。
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