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Ipomoea trifida (Kunth) G. Don (2n=2x=30)与栽培甘薯同属B群,是甘薯祖先种之一。由于倍性低,染色体数目少,携带有优异的抗逆基因,广泛用于模式研究和甘薯遗传改良。为充分挖掘其有价值的基因资源,本研究拟构建I.trifida基因组Fosmid文库,建立文库PCR筛选体系并在此基础上分离WRKY基因。主要研究内容及结果如下：1、Ltrifida Fosmid文库的构建与评价本项目通过流式细胞法测得I.trifida (2x,编号DLP4597)基因组大小为531.699Mbp。提取基因组DNA,通过物理剪切进行基因组DNA片段化并进行末端平滑化和磷酸化处理,脉冲场电泳回收33Kbp-48Kbp的DNA片段,然后连接到Fosmid载体pCC1FOS (Epicentre)上,包装转化大肠杆菌EPI300-T1R,构建了Ltrifida (2x)的基因组Fosmid文库。该文库包含101,952个单克隆,保存于1,062个96孔培养板中,平均插入片段35Kb,覆盖基因组约6.7倍,理论上任意片段筛出率达到99.88%。2、文库筛选体系的构建、检验及WRKY基因的分离以20个96孔板为一组构建三维PCR筛选体系,共分为53个组(第53组包含22个96孔板),每组包含1个超级池,20个板池,12个列池,8个行池,理论上最多通过93个PCR反应即可筛选到1个阳性单克隆。从I.trifida转录组测序结果中查找得到WRKY等10个基因的编码区序列,设计引物,进行筛选体系测试筛选,平均阳性克隆数为8.2个,最少阳性克隆数为3个,最多为16个。表明筛选体系效率较高,实际覆盖度与计算结果一致。提取I.trifida RNA,经反转录PCR分离WRKY基因cDNA序列,连接到pEasy T克隆载体(全式金),进行测序验证；将测序产物连接至pCAMBIA1301植物表达载体,以根癌农杆菌LBA4404菌株为媒介,转化烟草,获得转基因烟草植株共计7株。生根后移栽到花盆,提取转基因烟草DNA,经PCR检测所有植株均为阳性。提取转基因烟草RNA,半定量反转录PCR检测显示外源WRKY基因表达在7株转基因烟草间出现明显差异。每天定时以30mL20%PEG浇灌此7株转基因烟草,连续浇灌十天,七株烟草对模拟干旱的耐受性表现出明显差异,且与WRKY基因表达与否相关。Fosmid文库的构建,可为此物种全基因组测序提供工具和数据支撑,加速甘薯基因组学研究进程；此外,WRKY基因的分离与功能验证有望为甘薯抗旱育种提供优良基因资源。