目的凋亡抑制蛋白（inhibitor of apoptosis protein，IAP）IAP家族首先由Losis Miller等在杆状病毒CpGV和OPMNV发现，是一类新的独立于Bcl-2的抗凋亡蛋白。目前人类IAP家族已发现有8个成员，即NAIP，XIAP（ILP-1／MIHA），cIAP-1（HIAP-2／MIHB），cIAP-2（HIAP-1／MIHC），survivin（TIAP），apollon（Bruce），ILP-2（Ts-IAP）和Livin（ML-IAP／KIAP）。所有的IAPs都含有至少一个杆状病毒IAP重复基序结构（baculovirual inhibitor of apoptos is repeats，BIR），它的功能是特异性结合终末细胞死亡效应蛋白酶，例如半胱天冬酶（caspases）-和-7，结合的结果导致caspases活性显著降低，从而抑制了各种凋亡因子导制的细胞死亡。Livin是新近发现的一种IAP家族成员之一，其组织分布具有明显的细胞选择性，特异性表达于人的胚胎组织以及大多数人类实体瘤细胞。在正常成人组织如：脾、胸腺、前列腺、睾丸、小肠、结肠、卵巢、肝、肺、脑、骨骼肌和淋巴细胞以及外周血中无表达或低表达。Livin同样含有IAP家族成员特有的BIR和RING指结构域。与IAP家族其他成员氨基酸序列相似程度分别是：NAIP为25.5％、cIAP-1为24.1％、cIAP-2为26.1％、XIAP为34.7％、Survivin为26.3％。其高级结构更类似Survivin（生存素），含有4个α螺旋和一个反平行β折叠的BIR结构域（含一个丝／苏氨酸磷酸化位点），C端有RING结构域，但没有Survivin的螺旋-螺旋结构域。一些资料显示，Livin抗细胞凋亡的作用强于Survivin。Livin抗细胞凋亡作用主要是通过它的BIR结构和caspases结合，从而抑制caspases活性，特别是抑制Caspase 3／7和Caspase 9。研究表明，抑制凋亡可以导致癌症的发生和发展。同Survivin一样，凋亡抑制基因Livin在癌细胞系和变异细胞系中高表达，而在正常分化的组织中低或无表达。但目前国內外文献尚未见食管癌中Livin表达情况的报道。为此，我们采用逆转录-聚合酶链反应（reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR）结合银染技术检测36例食管癌组织和18例癌旁正常食管组织中LivinamRNA和LivinβmRNA的表达，并结合Western blot方法分析Livin蛋白的表达情况；采用免疫组织化学方法检测了36例食管癌组织和18例癌旁正常食管组织中Livin蛋白及P₅₃、Bcl-2蛋白的表达，并探讨Livin与P₅₃和Bcl-2之间的关系。我们还应用流式细胞术，对食管癌细胞的增殖活性和凋亡水平进行检测分析，期望证明Livin表达与肿瘤细胞的增殖和凋亡有关。材料与方法一、实验材料标本来源于中国医科大学第一临床学院胸外科2005年4月～2005年10月手术的患者，其中食管癌患者36例，癌旁正常食管组织18例；男性33例，女性3例，年龄41～81岁，平均年龄56.9岁。36例肿瘤组织中，3例低分化，18例中分化，15例高分化，其中食管鳞癌35例，食管腺癌1例，18例有淋巴结转移。所有患者术前均未行放、化疗。二、实验方法1、逆转录PCR检测Livin基因表达取100mg待检测组织，加入1ml Trizol溶液彻底匀浆。按Trizol试剂盒说明书用一步法提取总RNA，用DNA／RNA测定仪测定RNA浓度和纯度。反应体系中力口入10×RNA PCR Buffer 1μl、dNTP 1μl、MgCl₂ 2μl、Random 9mers 0.5μl、RNA 1μl、RNase inhibitor 0.25μl、Reverse Transcriptase 0.5μl、ddH₂O 3.75μl。反应条件：30℃10min，42℃30min，99℃5rain，5℃5min。Livin基因引物序列为5′-CATGGGTCTCCGTCCTCG-3’（上游）和5’-CAGGGAGCCCACTCTCGT-3′（下游）；在12-5μl反应体系中含有灭菌ddH₂O7.16μl、20pmol／L上、下游各0.15μl、cDNA2.5μl、Taq Hs 0.04μl、5×Buffer 2.5μl。反应条件：95℃2min，95℃1min，58℃1min，72℃1min，30个循环；72℃延伸7min。用内参照β-肌动蛋白（β-actin）检测逆转录效率。PCR产物用8％的聚丙烯酰胺凝胶电泳，100V，1.5h，电泳结束后，凝胶进行银染。凝胶自动成像仪进行摄像分析。应用TaKaRa公司100bp梯度Makers为分子大小对照确定电泳条带。2、Western印迹杂交RIPA buffer 200μl裂解冰冻组织标本；采用Folin-酚试剂法进行蛋白定量；聚丙烯酰胺凝胶电泳；NC膜（Millipore，USA）转膜2h，加入Livin兔抗人多克隆抗体（1：400，BIOCHEMICALS，USA）和β-actin鼠抗人单克隆抗体（1∶400，SIGMA，USA），室温孵育2h。加入碱性磷酸酶标记的羊抗兔和马抗鼠单克隆二抗，室温孵育2h，碱性磷酸酶显色15min，于自动电泳凝胶成像分析系统下成像，UPV凝胶分析系统采集数据。3、免疫组化法检测Livin、P₅₃、Bcl-2蛋白表达采用链霉菌抗生物素蛋白—过氧化酶连接（Streptavidin-peroxidase S-P）免疫组织化学方法，一抗Livin兔抗人多克隆抗体（美国BIOCHEMICALS公司产品），工作浓度1：200、P₅₃鼠抗人单克隆即用型抗体、Bcl-2鼠抗人单克隆即用型抗体，S-P试剂盒为福州迈新公司产品。实验步骤按试剂盒说明书进行。将已知阳性胃癌切片为阳性对照，用PBS代替一抗作为阴性对照。胞核、核膜或胞浆染为淡黄至棕黄色者为阳性细胞标志，将阳性细胞按其数量及显色强度分为3级：弱阳性（+）、阳性（++）牙口强阳性（+++）。4、流式细胞术检测食管癌细胞的增殖活性和凋亡水平切取深低温保存的组织块，网挫方法制备单细胞悬液，以PBS调整细胞数为1×10⁶／ml。一份加PI染色液（PI 5mg，Rnase 2mg，TritonX-1001ml，生理盐水65ml，枸椽酸钠100mg，加蒸馏水至100ml）1ml，置4℃冰箱中避光染色30min后上机分析。另一份中加入FITC-AnnexinV及PI各5μl，室温下避光静置15min后上机分析。所使用的流式细胞仪为FACSCalibur型（B．D，USA）。光源为488nm氩离子激光器，FITC受激发后发绿色荧光，PI发红色荧光，每份标本计数10000个细胞，然后在Macintosh 9.5计算机上用相关软件分析数据。测量前，以人淋巴细胞作为标准品调校仪器的CT值在3.0％以内。应用MetaMorph（CellQuest3.0）细胞周期分析软件，计算DNA组方图各时相分布的百分比，以增殖指数（proliferationindex，PI）表示增殖活性。二维点阵图上FITC高染而PI低染（FITC⁺PI^-）者为早期凋亡细胞，计算其所占的百分比。三、统计学分析计数资料采用X²检验，计量资料采用t检验，用SPSS13.0软件完成。结果1、Livin基因在食管癌组织中的表达情况Livin基因在36例食管癌组织中表达阳性率为50.0％（18／36），而在18例癌旁正常食管组织中低表达，阳性率为5.6％（1／18）两者之间差异显著（P＜0.05），两种异构体基本同时表达；RT-PCR和Western-blot两种检测方法结果一致。2、Livin基因的表达与食管癌组织临床病理特征的关系Livin基因的表达与食管癌患者的年龄、性别和分化程度无明显相关关系（P＞0.05），而与癌组织浸润深度、淋巴结转移和TNM分期有关（P＜0.05）。3、食管癌组织中Livin蛋白表达与P₅₃、Bcl-2蛋白表达的相关性Livin蛋白在36例食管癌组织中表达阳性率为47.2％（17／36），而在18例癌旁正常食管组织中低表达，阳性率为5.6％（1／18）两者之间差异显著（P＜0.05）。P₅₃蛋白表达阳性者中，Livin蛋白表达阳性率52.94％（9／17）、P₅₃蛋白表达阴性者中，Livin蛋白表达阳性率为42.11％（8／19），两者比较，无显著性差异（P＞0.05）。Bcl-2蛋白表达阳性者中，Livin蛋白表达阳性率为64.00％（16／25），Bcl-2蛋白表达阴性者中，Livin蛋白表达阳性率为9.09％（1／11），两者比较，差异有显著性（P＜0.01，r=0.452）。4、食管癌组织Livin基因表达与肿瘤细胞增殖的相关性36例食管癌组织的细胞增殖指数（PI）平均为（29.27±5.72）％。RT-PCR和Western-blot结果中，18例食管癌组织Livin表达阳性，PI为（31.55±6.19）％；18例Livin表达阴性，PI为（27.00±4.26）％，两者比较差异有显著性（t=2.566，P＜0.05）。免役组化结果中，17例食管癌组织Livin蛋白表达阳性，PI为（32.22±5.66）％；19例Livin蛋白表达阴性，PI为（26.64±4.43）％，两者比较差异有极显著性（t=3.310，p＜0.01）。5、食管癌组织中Livin基因表达与肿瘤细胞早期凋亡的相关性36例食管癌组织的肿瘤细胞早期细胞凋亡率平均为（2.43±0.91）％。RT-PCR和Western-blot结果中，18例食管癌组织Livin表达阳性，肿瘤细胞早期细胞凋亡率平均为（2.08±0.95）％；18例Livin表达阴性，肿瘤细胞早期细胞凋亡率平均为（2.78±0.73）％，两者比较差异有显著性（t=2.472，P＜0.05）。免役组化结果中，17例食管癌组织Livin蛋白表达阳性，肿瘤细胞早期细胞凋亡率平均为（1.91±0.63）％；19例Livin蛋白表达阴性，早期凋亡率为（2.89±0.87）％，两者比较差异有极显著性（t=3.837，P＜0.01）。结论1、Livin基因在食管癌中高表达，而在癌旁正常食管组织中低表达。2、Livin基因的表达与食管癌患者的年龄、性别和组织分化程度无关，而与癌组织浸润深度、淋巴结转移和TNM分期有关。3、食管癌组织中Livin蛋白表达与P₅₃蛋白表达无关，而与Bc1-2蛋白表达密切相关。4、食管癌组织Livin基因表达与肿瘤细胞增殖有关。5、食管癌组织Livin基因表达与肿瘤细胞早期凋亡有关。