【摘 要】
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天然产物因其显著的药用价值为人类生命健康和社会公共安全做出了巨大贡献,不断吸引各国研究工作者从自然中寻找和发现复杂多样的新型天然产物。对于化学结构独特、生物活性良好的天然产物有必要探究其生物合成过程,了解相关基因功能和酶学机制。本文从具有良好抗肿瘤活性的天然产物维里硫酰胺(TVA)出发,通过基因组挖掘的方法发现了一系列未被报道的TVA结构类似物。我们利用TVA生物合成基因簇中的前体肽基因tvaA在
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天然产物因其显著的药用价值为人类生命健康和社会公共安全做出了巨大贡献,不断吸引各国研究工作者从自然中寻找和发现复杂多样的新型天然产物。对于化学结构独特、生物活性良好的天然产物有必要探究其生物合成过程,了解相关基因功能和酶学机制。本文从具有良好抗肿瘤活性的天然产物维里硫酰胺（TVA）出发,通过基因组挖掘的方法发现了一系列未被报道的TVA结构类似物。我们利用TVA生物合成基因簇中的前体肽基因tvaA在NCBI数据库中进行相似序列检索,发现若干与之同源性较高的基因,由此进一步定位到相应的生物合成基因簇,并对其中来源于商品化菌株Streptomyces sp.NRRL S-87的基因簇展开了深入研究。从调取其生物合成基因簇后,我们利用CRISPR-Cas9基因编辑技术构建了△tvaAS-87的同框缺失突变株,与野生型对比发酵确定了新型维里硫酰胺类天然产物TVA-YJ-1和TVA-YJ-2的存在。在构建基因簇过表达的高产菌株后,我们着手对其进行大量发酵和产物分离,最终利用核磁共振和高分辨二级质谱成功鉴定了TVA-YJ-1、TVA-YJ-2及其衍生物的结构,并解释了各个化合物之间的转化关系。在对其生物合成基因簇中各个基因敲除工作中,我们在△tvaJS-87和△tvaGS-87的突变株中分别累积到比原始天然产物分子量减少16 Da和44 Da的中间体。生物信息学分析结果显示,tvaJS-87和tvaGS-87分别编码α-酮戊二酸依赖的氧化酶和SAM依赖的甲基转移酶。我们推测二者可能分别负责组氨酸残基上的羟基化和甲基化修饰。此外,我们通过构建相应的蛋白表达菌株成功获得可溶性蛋白TvaJS-87和TvaGS-87,为后续体外测活验证其生化功能打下基础。
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