HAb18G/CD147是一个广泛表达的跨膜糖蛋白,参与机体多种生理和病理过程,尤其在肿瘤侵袭转移,炎症发生发展等方面起着重要的作用,其分子作用机制尚未明确、空间结构未解析。由于该分子功能与胞外片断域(HAb18GEP)密切相关,因此对HAb18GEP进行空间结构研究十分必要,而进行该项研究的根本前提和基础是需要制备大量、高纯度的蛋白质。由于真核表达系统所固有的缺陷和复杂性,当前蛋白表达大多仍采用原核系统。然而外源蛋白在原核表达系统中往往形成不溶性的包涵体,这已成为当前蛋白质制备及结构研究的瓶颈。另一方面,蛋白质通过何种途径折叠形成天然结构,也是长期困扰该领域研究的难题。研究蛋白质折叠机理和过程将有助于解释蛋白结构和功能的关系,并对阐述蛋白质与生命现象的本质有着极其深远的意义。因此,本研究基于蛋白质折叠复性,旨在建立高效、实用的复性方法,以获得高纯度、高均一性天然结构蛋白HAb18GEP;另一方面,以蛋白折叠理论为依据,进行HAb18GEP折叠中间体的研究。研究分为四个部分:(一)HAb18GEP的原核表达与纯化。采用原核表达方式,筛选宿主菌种、优化培养条件,实现了HAb18GEP的高效表达,获得大量包涵体蛋白及微量可溶性蛋白。因其结构特点,以疏水相互作用色谱纯化包涵体蛋白、阴离子交换层析色谱纯化可溶性蛋白,所获蛋白纯度大于95%。ELISA测定其结合活性,以上两种蛋白均能与特异单抗结合,但包涵体蛋白亲和力较低。制备高纯度的包涵体蛋白为HAb18GEP的高效复性奠定了基础,而纯化获得的可溶性蛋白为复性研究提供了天然蛋白标准品。(二)甘油介导的疏水相互作用层析复性HAb18GEP。采用甘油介导的疏水层析复性HAb18GEP。考察了介质类型、甘油添加等关键因素对复性效果的影响,并与稀释复性效果进行了比较。本研究证实,疏水作用介质能够抑制复性过程中的蛋白聚沉,抑制作用与介质疏水性呈反比,但可导致蛋白的不可逆吸附;在层析流动相中加入甘油可克服以上不可逆吸附弊端,促进蛋白质的正确折叠。以此,建立了20%甘油介导的Poros ET疏水层析柱复性HAb18GEP技术,可溶性蛋白回收达到83%,正确折叠率为30%。以上结果表明,采用弱疏水作用介质与适宜浓度的甘油洗脱相结合,既可以抑制聚沉又可以促进蛋白正确折叠。(三)双梯度离子交换层析复性HAb18GEP。采用稀释复性方法考察蛋白质浓度、复性缓冲液温度、盐类、添加剂等因素对HAb18GEP折叠复性效率的影响,在此基础上研究了各因素对离子交换层析复性蛋白质的影响。本研究证实,缓冲液的pH值是影响蛋白质正确折叠以及二硫键正确配对的重要因素。因此,在用离子交换层析(IEC)复性含有两对二硫键的HAb18GEP过程中,引入pH梯度。变性蛋白质吸附于层析介质以后,环境的变性剂浓度逐步降低,pH值渐次升高,蛋白质分子在柱中经历逐渐变化的液体环境,逐步实现了循序渐进式的折叠。采用此方法复性HAb18GEP,可溶性蛋白回收率达95%,正确折叠率为67%,较甘油介导的疏水相互作用层析获得了更高的蛋白质正确折叠率,复性效率较为理想。采用反相色谱分离正确折叠的蛋白,利用ELISA、圆二色谱、荧光光谱、核磁共振等方法进一步检测其空间结构。结果表明,复性后的HAb18GEP具有良好的二级结构和三级结构,保持了天然蛋白质的理化性状。(四)HAb18GEP折叠中间体研究蛋白质的生物学功能与其通过折叠形成的特定空间结构密切相关。“折叠途径”学说认为,在蛋白质折叠途径中必然有中间体的产生,这样才能减少蛋白质折叠所搜索的空间范围,解决“Levinthal佯谬”。通过在脲中添加NaCl,成功地使HAb18GEP的去折叠从两态过程转变为三态过程,并诱导出去折叠平衡态和动力学中间体。研究发现在NaCl存在的条件下,HAb18GEP在高浓度脲中仍然存在一些残余的结构。NaCl可能通过稳定这些残余结构使中间体得以形成。据此推测,在脲变性HAb18GEP的去折叠过程中可能存在隐匿中间体。本文分别以疏水相互作用层析和离子交换层析研究HAb18GEP包涵体蛋白复性,均获得成功,尤其是IEC实现了HAb18GEP包涵体的高效复性。复性后蛋白质结构及生物活性与天然态一致,能替代去糖基化的天然蛋白的结构研究,目前应用此方法制备的HAb18GEP已用于NMR结构解析。该方法的建立也为层析复性其它类似膜蛋白提供了借鉴和思路。再则,本文以蛋白质“折叠途径”学说为基础,对HAb18GEP的折叠中间体进行了研究,发现氯化钠能够诱导脲变性HAb18GEP产生去折叠中间体,为深入研究蛋白质折叠途径提供了一定的实验依据,有助于了解不同折叠理论的内涵。