在我国,原发性肝癌是第二大癌症死亡原因,且其发病率呈上升趋势。年龄标准化后的肝癌5年相对生存率仅为14.1%。原发性肝癌起病隐匿,多数患者诊断时已处于中晚期而失去手术治疗机会。对于不能手术的患者,除局部治疗外,常需配合全身治疗。由于肝癌对化疗药物不敏感,目前患者能选择的全身治疗药物非常有限。因此,寻找能影响肝癌细胞生物学行为的靶点及其相应的靶向药物具有重要的临床意义。APOBEC3是近年来新发现的一类哺乳动物所特有的具有编辑RNA或DNA活性的胞嘧啶脱氨酶家族,该家族的许多成员可不同程度的影响基因组的稳定性。已有研究显示,APOBEC3可通过影响DNA的损伤修复能力,诱导基因突变,促进肿瘤的发生发展。在前期的临床资料分析和初步实验中,我们发现APOBEC3F高表达会促进肝癌细胞的转移。截止目前,关于APOBEC3F在肿瘤中的生物学功能尚未见报道。干蟾皮水提取物的化学成分复杂,含有多种活性成分,其中蟾毒灵(bufalin)是目前被公认的抗肿瘤作用最强的一种。许多体内外实验已证明蟾毒灵对多种肿瘤细胞具有促进凋亡,抑制增殖、侵袭转移、血管生成,及逆转多药耐药的作用。APOBEC3F在肝癌组织中的表达分布如何,通过何种机制影响肝癌细胞生物学行为及其对蟾毒灵的敏感性如何,解决这些问题有利于临床选择合适的病人使用以蟾毒灵为主要活性成分的抗肿瘤药物治疗,具有重要的临床意义。本研究分为以下三部分:第一部分APOBEC3F可作为肝细胞癌治疗的潜在靶点目的:明确APOBEC3F在肝癌组织中的表达分布,及对肝癌细胞生物学行为的影响,评估其作为肝癌治疗靶点的价值。方法:通过Gene Expression Omnibus(GEO)和The Cancer Genome Atlas(TCGA)数据库,分析APOBEC3F m RNA在肝癌组织及癌旁组织中的表达水平。并在8对肝癌肿瘤组织及对应的癌旁组织中验证APOBEC3F m RNA及蛋白表达水平。通过GSE14520及GSE36376数据库,分析APOBEC3F m RNA表达与肝癌临床病理学特征及生存期的关系。对SK-Hep1及Bel-7404肝癌细胞株进行APOBEC3F si RNA干扰,观察肝癌细胞增殖、转移能力改变。结果:GSE25097、GSE36376及TCGA数据库分析结果显示,与癌旁组织相比,APOBEC3F m RNA在肝癌患者肿瘤组织中显著高表达(P<0.001或P<0.01)。与健康患者相比,APOBEC3F m RNA在肝癌患者外周血中表达水平明显升高(P<0.05)。我们分析了8对肝癌患者肿瘤组织与癌旁组织APOBEC3F m RNA的表达水平,结果显示,6对肝癌患者(75%,6/8)肿瘤组织中APOBEC3F m RNA高表达,免疫组化及Western blot结果显示,APOBEC3F蛋白在肝癌患者肿瘤组织中高表达。我们分析了GSE36376数据集中240例手术切除术后肝癌患者的临床信息,结果显示,APOBEC3F m RNA高表达是肝癌患者发生血管侵犯、肝内转移及甲胎蛋白(alpha-fetoprotein,AFP)升高的危险因素(P=0.037,P=0.038和P=0.015)。APOBEC3F m RNA高表达组肝癌患者发生血管侵犯(59.2%比45.8%,P=0.039)、肝内转移(28.3%比17.5%,P=0.046)及AFP升高(39.2%比26.7%,P=0.039)的比例显著高于低表达组患者。在GSE14520及GSE36376两个数据集中,Cox回归分析结果显示APOBEC3F m RNA升高是肝癌患者无病生存期的危险因素(HR=1.32,95%CI=1.01–1.27,P=0.028与HR=3.38,95%CI=1.25–9.72,P=0.017)。GSE14520数据集中,Kaplan-Meier生存分析显示,APOBEC3F m RNA高表达组肝癌患者的无病生存期与低表达组患者相比明显缩短(32.25±3.81个月比42.68±2.06个月,log rank P=0.012);GSE36376数据集中,Kaplan-Meier生存分析结果显示,APOBEC3F m RNA高表达组肝癌患者的无病生存期低于低表达组患者(42.38±6.37个月比54.74±3.86个月),但无统计学差异(log rank P=0.065)。我们对SK-Hep1及Bel-7404肝癌细胞株进行APOBEC3F si RNA干扰,细胞计数显示APOBEC3F si RNA干扰24h后SK-Hep1及Bel-7404细胞数明显低于对照组(P<0.05和P<0.01),CCK8实验表明APOBEC3F si RNA干扰24 h、48 h、72 h后SK-Hep1及Bel-7404细胞的增殖能力明显降低(P<0.05,P<0.01或P<0.001)。细胞划痕实验表明,APOBEC3F si RNA干扰后,SK-Hep1及Bel-7404细胞株细胞迁移能力明显降低,且APOBEC3F si RNA干扰后SK-Hep1细胞形态由梭形向类圆形转化。结论:APOBEC3F m RNA及蛋白在肝癌患者肿瘤组织中高表达,与肝癌患者血管侵犯、肝内转移及AFP升高密切相关,是肝癌患者无病生存期的危险因素。抑制肝癌细胞APOBEC3F的表达可抑制癌细胞的增殖、迁移能力。因此,APOBEC3F可作为肝细胞癌治疗的潜在靶点。第二部分APOBEC3F介导的IgA生成相关肠道免疫网络在肝细胞癌中的作用目的:明确APOBEC3F介导的IgA生成相关肠道免疫网络信号通路在肝细胞癌发生发展中的作用。方法:通过Oncomine数据库分析APOBEC3F共表达基因,对APOBEC3F共表达基因进行KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)信号通路和GO(Gene Ontology)生物学过程富集分析,并对多数基因富集的IgA生成相关肠道免疫网络信号通路进行生物信息学分析。对SK-Hep1及Bel-7404肝癌细胞株进行APOBEC3F si RNA干扰,检测IgA生成相关肠道免疫网络信号通路关键分子的表达情况。进一步通过TCGA数据库分析信号通路下游基因p Ig R与肝细胞癌患者临床病理学特征及无病生存期的影响。结果:Oncomine数据库分析发现,128个基因与APOBEC3F共表达。对APOBEC3F的共表达基因进行富集分析,结果显示多数基因富集在IgA生成相关肠道免疫网络,Antigen processing and presentation及Cell adhesion moleculars信号通路中,而APOBEC3F的共表达基因主要参与的生物学过程是免疫反应(immune response)。KEGG信号通路中,Antigen processing and presentation及Cell adhesion moleculars均为IgA生成相关肠道免疫网络信号通路的重要组成部分。在SK-Hep1及Bel-7404肝癌细胞株中,APOBEC3F si RNA干扰后,Western blot结果显示IgA生成相关肠道免疫网络信号通路的关键分子CCR9、CCR10、CXCR4及p Ig R蛋白表达水平均有显著降低。我们通过TCGA数据库分析发现,IgA生成相关肠道免疫网络信号通路的下游基因p Ig R m RNA在肝癌患者肿瘤组织中显著过表达(P=0.003)。Oncomine数据库8个研究进行meta分析,结果显示p Ig R m RNA在肝癌患者肿瘤组织中显著过表达(P=1.18E-15),我们分析了4对肝癌患者肿瘤组织和癌旁组织中p Ig R蛋白表达水平,结果显示p Ig R蛋白在肝癌患者肿瘤组织中明显高表达。TCGA数据库中,p Ig R高表达组肝癌患者男性比例较高(74.0%比61.1%,P=0.009),年龄较大(61.30±12.68比57.55±14.29,P=0.009),合并肝癌危险因素的比例较高(80.7%比71.7%,P=0.045),发生肝硬化的风险较高(24.9%比13.9%,P=0.008),p Ig R高表达组肝癌患者的无病生存期显著低于p Ig R低表达组患者(中位生存期15.74个月比21.62个月,log rank P=0.0494)。结论:APOBEC3F可诱导IgA生成相关肠道免疫网络信号通路活化,促进p Ig R高表达,促进肝脏疾病进展,影响肝癌患者无病生存期。第三部分蟾毒灵抑制肝癌细胞增殖转移的新机制:调控APOBEC3F介导的IgA生成相关肠道免疫网络目的:寻找蟾毒灵抗肝细胞癌增殖转移作用的新分子机制。方法:在SK-Hep1及Bel-7404肝癌细胞株中验证蟾毒灵对APOBEC3F蛋白表达的影响,以及蟾毒灵对IgA生成相关肠道免疫网络信号通路中关键分子的表达改变。利用Bel-7404构建p Ig R稳定过表达及稳定敲减细胞株,利用C57BL/6小鼠,构建p Ig R稳定过表达及稳定敲减小鼠皮下瘤模型,观察p Ig R表达改变对C57BL/6小鼠皮下成瘤的影响及蟾毒灵对C57BL/6小鼠皮下瘤的作用。利用C57BL/6小鼠皮下瘤进行免疫组化检测Ki67、E-cadherin、N-cadherin及Vimentin表达改变。结果:CCK8实验表明蟾毒灵作用于SK-Hep1及Bel-7404细胞的IC50值分别为10n M和80n M。蟾毒灵作用于SK-Hep1及Bel-7404细胞株24h后,细胞的增殖能力显著降低,且蟾毒灵与APOBEC3F si RNA同时作用于上述两个肝癌细胞株对肝癌细胞增殖具有协同抑制作用。细胞划痕实验及Tranwell迁移实验显示,蟾毒灵可显著抑制肝癌细胞SK-Hep1及Bel-7404的迁移能力。Western Blot结果显示蟾毒灵可显著抑制SK-Hep1及Bel-7404细胞中APOBEC3F蛋白表达水平。蟾毒灵作用后,IgA生成相关肠道免疫网络信号通路的关键分子CCR9、CCR10、CXCR4及p Ig R蛋白表达水平均有显著降低。p Ig R敲减C57BL/6小鼠皮下瘤体积明显低于对照组(P<0.05);p Ig R过表达组肿瘤体积明显高于对照组(P<0.05)。蟾毒灵干预p Ig R过表达小鼠可有效抑制其肿瘤生长(P<0.05);同样,蟾毒灵作用于sh p Ig R小鼠可显著抑制其皮下移植瘤生长(P<0.05)。p Ig R过表达组C57BL/6小鼠瘤重及瘤体比明显高于对照组(P<0.001),p Ig R敲减组小鼠皮下瘤瘤重及瘤体比显著低于对照组(P<0.001)。p Ig R过表达蟾毒灵干预组小鼠瘤重明显低于p Ig R过表达组(P<0.0001);蟾毒灵作用于sh p Ig R小鼠可显著降低其皮下瘤瘤重(P<0.05)。我们通过免疫组化实验检测C57BL/6小鼠皮下瘤肿瘤组织中Ki67的表达水平,并通过H-scores半定量Ki67的表达量。结果发现,p Ig R过表达小鼠肿瘤组织中Ki67表达水平显著高于对照组(P<0.05),p Ig R敲减组小鼠肿瘤组织中Ki67的表达水平明显低于对照组(P<0.05)。蟾毒灵干预p Ig R过表达小鼠可有效降低其肿瘤组织中Ki67的表达,但无显著差异;而蟾毒灵作用于sh p Ig R小鼠可显著降低其肿瘤组织中Ki67的表达(P<0.05)。我们通过免疫组化实验检测C57BL/6小鼠皮下瘤肿瘤组织中Ecadherin、Ncadherin及Vimentin的表达水平。结果显示,改变p Ig R表达水平并未对Ecadherin的表达产生显著影响(P>0.05);p Ig R过表达可促进N cadherin及Vimentin的表达,p Ig R敲减可降低N cadherin及Vimentin的表达(P<0.05)。蟾毒灵干预可降低p Ig R过表达及敲减组N cadherin及Vimentin的表达水平,但无统计学差异。结论:蟾毒灵通过抑制APOBEC3F介导的IgA生成相关肠道免疫网络信号通路的活化,发挥抑制肝细胞癌增殖转移的抗肿瘤作用。APOBEC3F介导的IgA生成相关肠道免疫网络是促进肝细胞癌发生发展的新机制。