帕金森病（Parkinson’s disease，PD）是一种常见的与年龄相关的神经系统退行性疾病，其发病率仅次于阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease,AD），主要病理特征为中脑黑质致密部（substantia nigra pars compacta,SNpc）多巴胺能神经元的丢失以及神经元胞质内出现Lewy小体（Lewy bodies,LBs）。目前对于其发病机制的研究主要集中在未折叠或错误折叠蛋白质的聚集、线粒体功能障碍和氧化应激三个方面。越来越多研究发现以上病理改变与内质网应激（endoplasmic reticulum stress,ER stress）的发生发展密切相关。　　细胞内基因突变、氧化应激等因素均可破坏ER内稳态，内质网腔内氧化环境被改变，导致未折叠或错误折叠蛋白质在ER内大量积聚引起ER stress。位于内质网膜上的PERK、IRE1α、ATF6三种跨膜蛋白介导的信号通路被激活，启动未折叠蛋白反应（unfolded protein response,UPR）。在UPR三条通路中，IRE1α/XBP1是生物进化中最保守也较重要的一条通路。当发生ER stress时，IRE1α发生自身磷酸化而形成二聚体，通过其核酸内切酶活性对下游的X盒结合蛋白（X-box Binding Protein-1，XBP1）mRNA进行非传统剪接，剪去含有26个核苷酸的内含子，导致移码突变，进而翻译成一个具有转录活性的剪切型XBP1（spliced X-box Binding Protein-1,XBP1s）。多数研究发现XBP1s在炎症、脂质合成及能量代谢等方面起重要作用。另外，在PD细胞和动物模型中发现过表达XBP1s对MPP+和MPTP引起的细胞死亡有保护作用，但关于IRE1α/XBP1通路在PD中的作用机制还不清楚。　　细胞周期蛋白依赖性蛋白激酶5（cyclin-dependent kinase5,CDK5）是一种脯氨酸依赖的丝/苏氨酸蛋白激酶，在神经系统中高表达。研究证实CDK5在神经退行疾病中呈异常激活状态，并通过磷酸化多种蛋白分子参与神经元死亡的调控。　　基于以上研究背景，本研究分别在细胞及动物水平探讨IRE1α/XBP1通路在PD中的具体作用机制，并进一步探讨活化的CDK5通过调控XBP1s引起神经元死亡的具体分子机制。　　1.帕金森病细胞模型中IRE1α/XBP1通路激活分别在原代培养的不同时间点用MPP+处理皮层神经元，荧光定量RT-PCR法检测结果显示随着处理时间的延长，XBP1s mRNA表达水平升高，Western blot结果也显示IRE1α的磷酸化水平和XBP1s蛋白表达都随时间的延长而增高。以上结果表明在MPP+处理的帕金森病细胞模型中IRE1α/XBP1通路被激活。　　2.应用MPTP构建的帕金森病小鼠模型中IRE1α/XBP1通路激活选取25-30g左右的雄性小鼠，随机分两组，实验组小鼠以25mg/kg药量腹腔注射选择性破坏多巴胺神经元的神经毒素MPTP药物诱导帕金森病模型，对照组腹腔注射等剂量生理盐水。分离小鼠黑质组织，荧光定量RT-PCR法检测发现实验组小鼠黑质组织中XBP1s mRNA表达水平明显高于对照组。Western blot结果也显示IRE1α的磷酸化水平和XBP1s蛋白表达水平与对照组相比也明显增高。表明在MPTP药物诱导的帕金森病动物模型中IRE1α/XBP1通路也被激活。　　3.帕金森病转基因动物模型的中脑黑质组织中IRE1α/XBP1通路激活选取年龄为2个月、15个月的转基因小鼠（Th-SNCA*A30P*A53T）（TG）及对应年龄的正常同窝对照小鼠（野生型，WT），分离黑质区组织，荧光定量RT-PCR法和Western blot检测结果显示XBP1s的mRNA和蛋白表达水平在15个月的TG鼠的黑质组织中明显增高。同时在15个月TG鼠中IRE1α的磷酸化水平也出现明显上调，以上结果均提示在帕金森病TG动物模型中IRE1α/XBP1通路被激活。　　4.帕金森病中XBP1s发生CDK5依赖的核转位分别在原代培养的不同时间点用MPP+处理皮层神经元，Western blot方法检测结果表明在神经元细胞核裂解液中XBP1s表达随着处理时间的延长明显增多。而在MPP+处理细胞前30min加入CDK5抑制剂Roscovitine处理后，XBP1s入核明显减少。上述结果显示XBP1s的核转位可能与CDK5有关。　　5.帕金森病中XBP1s的核转位不依赖于p38MAPK有文献报道p38MAPK可磷酸化XBP1s并促进其核转位，为验证在神经元中XBP1s核转位是否与p38相关，应用MPP+处理的神经元，Western blot方法检测结果显示在MPP+处理的神经元中几乎检测不到p-p38的表达。在MPP+处理神经元前30min加入p38抑制剂SB203580，发现p38被抑制后并没有影响XBP1s的核转位，说明在MPP+处理的神经元中XBP1s的核转位增多与p38无关。　　6.CDK5介导帕金森病中XBP1s的磷酸化应用XBP1抗体免疫沉淀MPP+处理神经元总蛋白，用Phos S/TP抗体进行检测，结果发现MPP+处理神经元中XBP1s的磷酸化水平与对照组相比显著升高。而在CDK5基因敲除小鼠的大脑皮层组织裂解液中，XBP1s磷酸化水平与同窝对照组WT小鼠相比明显降低。另外，应用免疫共沉淀方法在体内和体外均验证了XBP1s和CDK5两者存在相互作用。表明帕金森病中XBP1s磷酸化水平增高，并与CDK5有关。　　7.CDK5可直接磷酸化XBP1s的Ser61位点应用生物信息学软件GPS3.0、Scansite及DNAMAN7等软件对其进行预测，发现Ser61是CDK5潜在的磷酸化位点。体外合成含XBP1sSer61位点的11肽（序列为RLTHLSPEEKA），并作为底物与CDK5/p25激酶进行体外激酶反应，应用磷酸化质谱进行分析，结果显示CDK5可磷酸化XBP1s Ser61位点。体外诱导表达野生型的GST-XBP1-WT和磷酸化位点突变的GST-XBP1s-S61A蛋白，分别与CDK5/p25激酶进行体外激酶反应，应用Phos S/TP抗体和Phos-tag技术检测结果也均显示GST-XBP1s-WT可被CDK5磷酸化，而磷酸化位点突变的GST-XBP1s-S61A蛋白不能被磷酸化。体外合成包含XBP1s Ser61磷酸化位点的穿膜肽Myr-RLTHLSPEEKA，穿膜肽可进入神经细胞，并竞争性的与CDK5结合，进而阻断CDK5对细胞内XBP1s Ser61位点的磷酸化；在MPP+处理神经元的细胞模型中加入上述穿膜肽，结果发现穿膜肽对MPP+导致的神经元死亡具有保护作用。更进一步表明，在帕金森病中CDK5可能通过磷酸化XBP1s Ser61位点引起多巴胺能神经元的死亡。　　8.XBP1s蛋白的Ser61位点磷酸化促进其核转位在原代培养皮层神经元中分别转染带有绿色荧光蛋白（GFP）标签的野生型质粒pEGFP-XBP1s-WT和模拟磷酸化的（phosphomimetic）质粒pEGFP-XBP1s-S61D，24h后荧光显微镜下观察发现XBP1s-WT蛋白在细胞浆和细胞核中均有表达，而XBP1s-S61D蛋白主要在细胞核中表达。HEK293细胞中共转HA-CDK5/Myc-p35，pEGFP-XBP1s-WT或pEGFP-XBP1s-S61A质粒，转染24h后用GFP抗体检测，结果显示在过表达CDK5/p35的情况下XBP1s-WT蛋白入核明显增多，而磷酸化位点突变的XBP1s-S61A蛋白入核明显减少。以上结果表明XBP1s蛋白的Ser61位点磷酸化可促进其核转位。　　9.磷酸化XBP1s核转位调控下游多个基因表达XBP1s Ser61位点的磷酸化可促进XBP1s入核，发挥其转录因子的作用，影响下游基因表达。为研究XBP1s入核调控下游基因的表达情况，在HEK293细胞中分别过表达pEGFP-XBP1s-S61D和空白对照质粒，24h后分别提取总RNA，应用RNA-Seq方法进行转录组检测。对上述两组细胞中基因按照表达差异（fold change）大于2.0倍且具有统计学差异（P<0.01）的标准进行筛选，共得到96个差异表达基因，与空白质粒组相比，其中91个基因在过表达XBP1s-S61D组表达上调，5个基因下调。对上述差异表达基因进行功能富集和Pathway分析，发现过表达XBP1s-S61D组中多个与细胞内代谢、凋亡和非编码RNAs等相关基因表达上调。　　本研究发现帕金森病中IRE1α/XBP1通路激活，XBP1s发生核转位；XBP1s核转位与CDK5相关，但与p38无关；帕金森病发病过程中活化的CDK5可与XBP1s相互作用，并通过磷酸化XBP1s Ser61位点促进其核转位；XBP1s核转位导致XBP1s下游与细胞内代谢、凋亡及非编码RNAs等相关基因的表达上调，而这些上调的基因可能参与帕金森病中神经元死亡的相关机制，为帕金森病发病机制的研究提供新的分子靶点。