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副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)是一种重要的食源性致病菌，人们食用受该菌污染的食物后会引起腹泻、呕吐等，重症患者还会脱水、休克，甚至死亡。目前，副溶血弧菌引起食物中毒的发生规模以及人群暴露规模呈明显上升趋势，已成为我国首要的食源性致病菌。常用的副溶血弧菌检测方法包括传统培养方法、免疫学方法以及PCR等分子生物学方法，但这些方法在特异性、灵敏度、检测周期、操作难易度以及检测成本等方面各有缺点。因此，发展新的快速准确、操作简便、成本低廉的检测与鉴定副溶血弧菌的方法是及时有效地预防和控制此致病菌传播的前提，对于提高食品卫生水平、保证食品安全具有重要的意义。
环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)是一种新颖的核酸扩增技术，它依赖于能够识别靶DNA上6个特定区域的4条引物和一种具有链置换活性的DNA聚合酶，在恒温条件下高效扩增核酸，1h即可完成，具有高特异性、快速灵敏、高效、操作简便等特点，它的应用可以弥补现有一些副溶血弧菌检测方法的不足。
本研究首次将环介导等温扩增技术应用于副溶血弧菌的快速检测，建立了一种针对副溶血弧菌不耐热溶血毒素基因(tlh)的LAMP检测方法，并应用于水产品中副溶血弧菌的直接检测。
1、副溶血弧菌LAWP检测方法的建立针对副溶血弧菌种特异性基因-不耐热溶血毒素基因(tlh)设计了三套LAMP引物(包括两条内引物和两条外引物)，选用其中一套能够成功扩增该基因的特异性LAMP引物，对扩增反应体系和条件进行优化，建立副溶血弧菌LAMP检测方法。经过优化的LAMP反应体系(25μL)包括：8 mM MgSO4、1.0 mM dNTPs、0.8 M甜菜碱、1.2μM FIP-3引物、1.2 μM BIP-3引物、0.2μM F3-3引物、0.2μM B3-3引物、8 U Bst DNA聚合酶大片段、1×ThermoPol Reaction buffer以及适量的DNA模板；最佳反应温度60℃，反应时间60 min。
2、副溶血弧菌LAMP检测方法的特异性和灵敏度评价采用该LAMP方法对12种实验细菌共31株进行检测，仅副溶血弧菌得到阳性结果，表明该方法具有很高的特异性；以副溶血弧菌标准菌株为实验菌株，该方法对于基因组DNA的检测限约为90fg/25μL LAMP反应体系，对于细菌纯培养物检测限约为24 cfu/mL，直接对食品样品中的副溶血弧菌进行检测的灵敏度为89 cfu/g。同时，采用PCR方法进行平行检测比较，结果显示，两种方法的检测特异性一致，但LAMP法的检测灵敏度普遍比PCR法高出3～4个数量级。
3、副溶血弧菌LAMP检测方法的应用将建立的LAMP方法应用于水产品样品的实际检测，同时采用PCR方法和传统培养方法进行平行检测比较。对于泥蚶、青蛤等42份水产品样品，LAMP方法和PCR方法均检出8份副溶血弧菌阳性(2份青蛤、4份缢蛏和2份牡蛎)，传统培养方法检出6份阳性(2份青蛤、2份缢蛏和2份牡蛎)。
本研究表明，所建立的副溶血弧菌LAMP检测方法特异性强、灵敏度高，使用恒温水浴装置1h即可完成反应，不需要使用昂贵、精密的仪器设备和特殊试剂，并且可以通过目测反应体系浊度变化进行产物检测，实现反应及产物检测一步完成，与现有副溶血弧菌检测方法相比，耗时短、操作更简便、检测成本更低，可作为快速检测副溶血弧菌的有效手段，尤其适用于基层检验检疫机构。