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鹿茸为雄鹿的第二性征,是鹿进入青春期后在额骨顶部长出的包括血管、皮层、软骨等多个组织形成的器官。梅花鹿鹿茸是哺乳动物中唯一可完全再生的骨质器官,有着其它动物不可比拟的生长速度和超强的稳定性,是研究器官再生和创伤修复的理想模型。鹿茸经过特殊的骨形成方式完成周期性的再生,这个过程是由多种因素共同作用的结果。转化生长因子(Transforming growth factor,TGF)广泛分布于成纤维及上皮细胞内。研究表明TGF-β2存在于鹿茸顶端组织中,可与Wnt信号通路协同促进上皮细胞向间充质细胞的转化,并使细胞维持在间充质状态。而鹿茸顶端软骨组织形成的最初阶段源于间充质的快速生长。故TGF-β对鹿茸软骨快速生长阶段的调控机理需要进一步的研究。本实验应用PCR技术克隆获得梅花鹿TGF-β2基因编码区全长cDNA序列,将其纯化回收并构建重组质粒pMD-18T-TGF-β2,转化大肠杆菌DH5a中后进行PCR及双酶切鉴定,最后进行核苷酸序列测定。应用免疫组织化学法检测TGF-β2在梅花鹿鹿茸顶端不同组织的表达。应用Trizol试剂法提取鹿茸顶端软骨及间充质细胞总RNA,并进行HiSeq深度测序。合成TGF-β2基因3’非编码区野生型序列,运用生物信息软件TargetScan预测与TGF-β23’UTR特异性结合的miRNA,再利用制备的HiSeq深度测序结果筛选出在鹿茸顶端软骨及间充质细胞中差异表达的miRNA。应用qPCR验证鹿茸软骨组织中部分差异表达的miRNA,并选用表达水平最高的miRNA-148a-3p进行后续的实验。构建野生型及突变型双荧光素酶报告基因载体pmiR-Report-TGF-β2-3’UTR,将miRNA-148a-3p模拟物分别与两种质粒共同转染到鹿茸软骨细胞,检测双荧光素酶活性,从而证实TGF-β2的3’UTR确实存在miRNA-148-3p的结合位点。荧光定量PCR检测转染外源miRNA-148-3p模拟物后,其在鹿茸软骨细胞内的相对表达水平。Western blotting检测转染miRNA-148a-3p后TGF-β2蛋白的表达水平及其对相关蛋白TGF-βRⅡ和IGF-1表达的影响,MTT法检测转染miRNA-148a-3p后鹿茸软骨细胞增殖的影响。实验结果表明,成功获得梅花鹿TGF-β2基因序列,该基因长1245bp,与牛、羊、马、人的核苷酸序列同源性为98.55%、98.47%、94.46%、93.90%;通过DNAMAN比较梅花鹿TGF-β2与牛、羊、马、人的氨基酸序列同源性分别为99.28%、99.28%、99.03%、98.79%。免疫组织化学法结果表明,TGF-β2在鹿茸顶端组织茸皮层、间充质及软骨层中均有表达,且在软骨中表达水平最高。为了验证miRNA-148a-3p与梅花鹿鹿茸TGF-β2的关系及其对鹿茸软骨细胞增殖的影响,本实验成功合成含有miRNA-148a-3p结合位点的TGF-β2 3’UTR野生型及突变型序列。并成功构建野生型及突变型双荧光素酶报告基因载体。荧光素酶活性检测结果显示:与阴性对照组相比,转染野生型重组质粒和miRNA-148a-3p的细胞组,荧光素酶活性下降;而共转染突变型重组质粒和miRNA-148a-3p的细胞组,其活性未发生明显变化。结果表明TGF-β2是miRNA-148a-3p调控的靶基因。MTT法和Western blotting结果显示,转染miRNA-148a-3p后鹿茸软骨细胞增殖受到抑制,TGF-β2蛋白及相关蛋白TGF-βRⅡ和IGF-1的相对表达水平下降,且呈时间依赖性。