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乳铁蛋白(Lactoferrin, LF)是一种具有多重生理功能的天然铁结合性糖蛋白,近年来其成骨活性成为了研究热点,然而LF的作用机制尚不明确。本研究在细胞和分子层面,首次对牛LF作用于成骨细胞的信号转导机制进行了研究。本研究利用原代成骨细胞和前成骨细胞系MC3T3-E1,证明了LF可以有效促进分化标志物碱性磷酸酶(ALP)的活性以及骨钙素(OCN)的表达,并且能够提高成骨细胞矿化结节的形成,说明LF对于成骨细胞分化具有全面的促进作用。同时本研究发现,LF促进成骨细胞分化与转录因子Runx2的激活有关。MAPK信号通路是调控成骨细胞分化过程的重要途径。本研究分析了LF刺激下,成骨细胞内MAPK通路的激活及作用。LF刺激MC3T3-E1细胞后,细胞内p38磷酸化水平和激酶活性显著升高,利用通路抑制剂和siRNA基因沉默技术阻断p38MAPK通路后,LF的促分化作用显著降低,同时Runx2的磷酸化也受到显著抑制,说明LF发挥其活性依赖于p38-Runx2通路的激活。另外,LF还能够激活成骨细胞内PKA通路。使用抑制剂阻断PKA通路后,p38通路的激活亦被阻断,并且LF的促分化作用受到显著抑制,说明PKA是位于p38上游的关键靶点,与p38共同介导了LF的信号传导。本研究首次发现p38MAPK信号通路是调控LF促成骨细胞分化的核心途径。为了进一步阐明LF的信号转导途径,本论文研究了LF受体LRP1的作用。通过构建含有LRP1-shRNA干扰序列的pGLV3-LRP1-shRNA载体,并利用慢病毒转染技术,成功建立了稳定沉默LRP1基因的MC3T3-E1细胞模型MC-L4。LF刺激MC-L4细胞后,ALP活性和OCN表达显著增加,与正常细胞中的LF促进效果相同,充分证明了LF受体LRP1并不参与LF对成骨细胞分化的促进过程。此外,本研究还分析了内吞过程对于LF发挥其活性的影响,在抑制内吞条件下,LF依然可以激活PKA-p38通路,证明了LF发挥其促成骨细胞分化活性并不依赖于内吞过程。最后,本研究对MC3T3-E1细胞和LRP1稳定沉默细胞MC-L4,利用抗体芯片技术,分析了LF刺激下两种细胞中53种生长因子表达的情况。LF能够有效促进Thrombospondin-2, Serpin E1, MCP-1, PDGF-AA, Angiogenin, FGF-basic, Cyr61等7种因子的表达；抑制Serpin F1的表达。调控成骨细胞生长因子的表达,可能是LF调控成骨细胞功能的间接方式。综上所述,本研究首次报道了LF促进成骨细胞分化的信号转导机制,发现PKA-p38-Runx2是LF促成骨细胞分化的核心通路,并且LF发挥其活性并不依赖于LRP1受体以及内吞过程。此外,LF还可以促进成骨细胞内多种生长因子的表达,可能通过自分泌或者旁分泌的方式对成骨细胞分化产生影响。本研究不仅填补了LF促成骨细胞分化相关机理研究的空白,也为LF作为预防和治疗骨质疏松症的功能活性物质的开发提供了理论支持。