大丽轮枝菌VdCPMO基因克隆与功能研究

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大丽轮枝菌是一种分布广泛的土传病原真菌,能够在660多种植物上引起黄萎病,造成巨大的经济损失。微菌核是大丽轮枝菌特殊的休眠结构,可以在土壤中长期存活,是病害的主要初侵染来源。微菌核的萌发是大丽轮枝菌成功侵染寄主的先决条件,但迄今为止,尚未见微菌核萌发相关基因的研究报道。本研究在前期微菌核萌发表达谱的基础上,选择上调倍数最高的环戊酮1,2-单加氧酶基因(VDAG_03943),进行克隆与功能研究。主要取得了如下结果:  1.基于已公布的大丽轮枝菌VdLs.17的基因组序列,克隆得到VDAG_03943序列,该基因全长1929bp,cDNA序列全长1668bp,编码555个氨基酸组成的蛋白,命名为VdCPMO。利用一步法的载体构建方法成功得到了VdCPMO的敲除质粒pOSCAR-CPMO。  2.通过农杆菌介导的遗传转化方法,从野生型菌株JY中敲除了VdCPMO,经过50mg/L的潮霉素抗性筛选,得到了26株候选的敲除转化子菌株。分别使用潮霉素基因检测引物Hyg-F和Hyg-R、目的基因检测引物CPMO-F和CPMO-R进行PCR验证,确认得到了敲除突变体菌株ΔCPMO-1和ΔCPMO-2。利用PEG介导的原生质体转化方法进行功能互补后,得到了14株互补转化子菌株,经过G418抗性筛选、表型测定和PCR扩增检测后,确认得到3株互补突变体菌株,将其中1株互补突变体菌株并命名为ΔCPMO-C进行后续试验。  3.敲除突变体菌株ΔCPMO-1、ΔCPMO-2,互补突变体菌株ΔCPMO-C和野生型菌株JY的菌落生长情况、微菌核萌发率、芽管平均长度的测定结果表明,敲除突变体菌株ΔCPMO-1和ΔCPMO-2的菌落生长减慢,微菌核萌发率显著降低,芽管平均长度明显较短,而互补突变体菌株ΔCPMO-C与野生型菌株JY间无显著性差异;对棉花和烟草植株致病力测定结果表明,敲除突变体菌株ΔCPMO-1和ΔCPMO-2的微菌核丧失了对棉花的致病力,同时对烟草的致病力有所下降,而互补突变体菌株ΔCPMO-C和野生型菌株JY间的致病力无差异。
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